[發(fā)明專利]DHPLC檢測并定量線粒體DNA1555A>G的異質(zhì)性突變

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310302286.4
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103436604A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王沙燕;沈姍姍;王琳凱
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市人民醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 東莞市創(chuàng)益專利事務(wù)所 44249
• 代理人: 李衛(wèi)平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA?檢測領(lǐng)域，尤其涉及檢測線粒體DNA?1555AG突變及其定量的方法。?

背景技術(shù)

人類線粒體DNA(mitochondrial?DNA,??mt?DNA)是唯一分布于細(xì)胞核外的人類遺傳物質(zhì),又被稱為人類的第25號染色體,呈雙鏈環(huán)狀。?1981年Anderson完成了人類整個(gè)線粒體DNA?16569bp的測序工作,?并將線粒體DNA分成編碼區(qū)和控制區(qū)。線粒體基因組的遺傳特點(diǎn)是母系遺傳與異質(zhì)性(heteroplasmy)。即在同一個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)兩種或兩種以上類型的mtDNA，突變型線粒體DNA占全體線粒體DNA的百分比稱為突變負(fù)荷，異質(zhì)性線粒體DNA的突變負(fù)荷可以介于0到100％之間，線粒體DNA疾病的發(fā)生及其臨床表型往往取決于突變負(fù)荷的高低，當(dāng)線粒體DNA突變體的突變負(fù)荷較低時(shí)，共存的野生型線粒體DNA會(huì)發(fā)揮保護(hù)和補(bǔ)償作用；然而，當(dāng)突變水平超過一定的閾值，野生型線粒體DNA不能補(bǔ)償同時(shí)存在的突變DNA所產(chǎn)生的缺陷，不足以維持正常功能時(shí)，組織或器官就會(huì)出現(xiàn)功能異常。?

1993年，Prezant?TR等首次發(fā)現(xiàn)線粒體DNA（mitochondrial?DNA，mtDNA）12S?rRNA基因的1555A>G突變與氨基糖甙類藥物性耳聾有關(guān)，且研究報(bào)道大都為同質(zhì)性突變。由于線粒體DNA?1555A>G突變致聾的不同家系或同一家系的不同成員在臨床表型及外顯率方面顯示出較大差異，主要表現(xiàn)在氨基糖甙類藥物致聾影響程度多樣化、發(fā)病年齡多樣化、表現(xiàn)度多樣化、不同種族不同地域間發(fā)生率多樣化等方面。而同質(zhì)性的mtDNA1555A>G突變始終無法從分子水平上給予臨床表型多樣化的分子基礎(chǔ)一個(gè)合適的解釋。該部位突變是否存在異質(zhì)性？其異質(zhì)性水平是否與臨床表型之間存在著一定的關(guān)系？目前傳統(tǒng)檢測技術(shù)在檢測mtDNA1555A>G異質(zhì)性上有一定的局限性,常采用PCR-RFLP和直接測序法對mtDNA1555A>G的異質(zhì)性進(jìn)行檢測，但這些方法只能檢測到高于20%的突變異質(zhì)性水平，從而導(dǎo)致低水平的異質(zhì)性突變無法被檢出，而被認(rèn)為是同質(zhì)性突變或是同質(zhì)性野生型，檢測靈敏度不高，從而也無法解釋臨床表型多樣化的原因。因而探索一種檢測線粒體DNA?1555A>G異質(zhì)性突變及定量分析的方法顯得十分重要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡單、準(zhǔn)確且快速靈敏的運(yùn)用DHPLC方法對線粒體DNA?1555A>G的異質(zhì)性突變進(jìn)行檢測及定量的方法，靈敏度高，且操作方便。?

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：?

DHPLC檢測并定量線粒體DNA?1555A>G的異質(zhì)性突變，包括如下步驟：

1）提取線粒體DNA；

2）引物設(shè)計(jì)，根據(jù)DHPLC方法的原理及檢測要求，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；

3）確定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，采用優(yōu)化好的引物及PCR體系對線粒體DNA?1555A>G進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；

4）用DHPLC方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行異質(zhì)性突變的檢測：

將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在PCR儀中95℃變性5min，然后以1℃/min的速度緩慢降溫至25℃，以充分形成異源性DNA雙鏈；

然后采用DHPLC分析儀分析，每次自動(dòng)進(jìn)樣8μL，采用流動(dòng)相A液（0.1mmol/L?TEAA，0.025％乙腈）和B液（0.1mmol/L?TEAA，25％乙腈）將樣本從分離柱中洗脫，檢測柱溫為59.5℃，洗脫液流速為0.9mL/min，洗脫曲線由紫外檢測器檢測獲得，紫外檢測器在260nm波長處收集信號。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2）的引物設(shè)計(jì)含以下序列：?

正向序列：5’gctcagcctatataccgccatcttcagcaa3’；

反向序列：5’TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTG3’。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2）的引物設(shè)計(jì)中，目的片段長度為339bp，且變異位點(diǎn)靠近下游引物的3’端。?

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟3）的PCR反應(yīng)體系為：50μL反應(yīng)體系，含100ng模板DNA，10μmol/L上、下游引物各1μL，10mmol/L?dNTP?1μL，25mmol/L?Mg²⁺?3μL，10×Buffer?5μL，5U/μL?Taq?DNA聚合酶3μL。?