[發(fā)明專利]逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)登革2型病毒的試劑及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310302164.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103382509A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂沁風(fēng);吳忠華;鄭偉;羅鵬;李禾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)登革2型病毒的試劑，其特征在于：它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP；引物基因序列如下：

外引物F3：GAGCAGATCTCTGATGAATAACCAA；

外引物R3：CATTCTGCCTGAGAAGAGGACAC；

內(nèi)引物FIP：

GAACAGTTTTAATGGTCCTCGTCCCGAGATTCTCACTTGGAATGCTGC；

內(nèi)引物BIP：

TGCTGAACATCTTGAACAGGAGACGCAACGCCATCACTGTTGGAATCA。

2.一種逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)登革2型病毒的方法，其特征在于：

逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增RT-LAMP反應(yīng)體系為25μL，組分為：

10×buffer2.5μL；

引物混合物1μL，權(quán)利要求1所述的內(nèi)引物FIP與內(nèi)引物BIP在所述反應(yīng)體系中的濃度均為800pmol/L，外引物F3與外引物B3濃度在所述反應(yīng)體系中的濃度均為40pmol/L；

模板RNA2μL；

8U?BstDNA聚合酶1μL；

10U?AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL

8mol/L的甜菜堿2μL；

10mmol/L?dNTP2μL；

100mmol/L?MgSO₄1.2μL；

加入DEPC-H₂O補(bǔ)足25μL；

提取樣本RNA，將樣本RNA和陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別加入所述RT-LAMP擴(kuò)增體系中，將陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)樣本按上述反應(yīng)體系孵育63℃1h進(jìn)行反應(yīng)，其中陰性對(duì)照采用DEPC-H₂O，陽(yáng)性對(duì)照采用登革2型病毒非感染體外轉(zhuǎn)錄RNA；反應(yīng)結(jié)束后，采用以下方法中的至少一種方法觀察結(jié)果：

1）、取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒(méi)有條帶產(chǎn)生，檢測(cè)樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有登革2型病毒，反之沒(méi)有登革2型病毒；

2）、反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照管可見(jiàn)白色沉淀，陰性對(duì)照管沒(méi)有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有登革2型病毒，反之沒(méi)有登革2型病毒；

3）、在反應(yīng)體系中加入2μL熒光染料SYBR?Green?I或者Eva?Green，紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光則含有登革2型病毒，反之沒(méi)有登革2型病毒。