[發明專利]一種提高Vγ9Vδ2T細胞擴增效率及活性的培養方法

無效

• 申請號: 201310299928.X
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103555666A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 黃河;吳康妮;胡永仙;盛立霞
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種提高Vγ9Vδ2T細胞擴增效率及活性的培養方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）人單個核細胞制備：應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清完全RPMI?1640培養液重懸細胞；

（2）Vγ9Vδ2T細胞誘導：步驟（1）中所制備的單個核細胞接種當日按第0天計算，在第0天加入唑唻膦酸及IL-2，在第1天加入達沙替尼，接著于第3、6、9、12、15、18天進行半量換液，每次換液時加入新鮮IL-2及達沙替尼；

（3）Vγ9Vδ2T細胞擴增效率檢測：于第9、12、15、18天收集步驟（2）中的細胞，采用流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞的純度，以TCRVδ2陽性作為Vγ9Vδ2T細胞的表型特征，計算Vγ9Vδ2T細胞占外周血單個核細胞的百分含量；采用細胞計數儀檢測活細胞密度，并根據以下公式計算Vγ9Vδ2T細胞的絕對數量：

Vγ9Vδ2T細胞絕對數量=?Vγ9Vδ2T細胞純度×活細胞密度×總體積；

（4）誘導的Vγ9Vδ2T細胞表面活化分子及死亡受體檢測：于第18天收集步驟（2）中的細胞，采用流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞表面活化分子CD69、HLA-DR及死亡受體Fas分子表達的比例，以TCRVδ2陽性作為Vγ9Vδ2T細胞的表型特征，計算公式為：

Vγ9Vδ2T細胞CD69/HLA-DR/?Fas表達（%）=?CD69/HLA-DR/Fas和TCRVδ2雙陽性細胞/?TCRVδ2單陽性細胞×100；

（5）誘導的Vγ9Vδ2T細胞效應型亞群比例檢測：于第18天收集步驟（2）中的細胞，采用流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞的功能亞型分布，以TCRVδ2陽性作為Vγ9Vδ2T細胞的表型特征，以CD27分子為區分效應型亞群的表型特征，計算公式為：

Vγ9Vδ2T細胞效應型亞群比例（%）=?CD27陰性TCRVδ2陽性細胞/?TCRVδ2單陽性細胞×100；

（6）誘導的Vγ9Vδ2T細胞對腫瘤細胞的的穿孔素、顆粒酶釋放效應檢測：于第18天收集步驟（2）中的細胞，采用流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞與急性髓系白血病細胞株K562共同孵育4個小時后檢測Vγ9Vδ2T細胞對AML細胞刺激的穿孔素、顆粒酶釋放效應，以TCRVδ2陽性作為Vγ9Vδ2T細胞的表型特征，以CD107a分子陽性作為穿孔素、顆粒酶釋放效應的檢測標記，計算公式為：

Vγ9Vδ2T細胞穿孔素、顆粒酶釋放效應（%）=?CD107a和TCRVδ2雙陽性細胞/?TCRVδ2單陽性細胞×100；

（7）誘導的Vγ9Vδ2T細胞干擾素-γ細胞因子分泌能力檢測：于第18天收集步驟（2）中的細胞，采用流式細胞術檢測Vγ9Vδ2T細胞在PMA/離子霉素刺激4個小時后檢測Vγ9Vδ2T細胞干擾素-γ細胞因子的分泌能力，以TCRVδ2陽性作為Vγ9Vδ2T細胞的表型特征，以胞內干擾素-γ分子陽性作為Vγ9Vδ2T細胞分泌干擾素-γ細胞因子的檢測標記，計算公式為：

????Vγ9Vδ2T細胞IFN-γ分泌能力（%）=干擾素-γ和TCRVδ2雙陽性細胞/?TCRVδ2單陽性細胞×100。

2.根據權利要求1所述的一種提高Vγ9Vδ2T細胞擴增效率及活性的培養方法在體外誘導培養Vγ9Vδ2T細胞中的應用。?