[發明專利]一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NS1蛋白的方法

無效

• 申請號: 201310299415.9
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103436557A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 李國輝;王鵬;唐琦;胡朝陽;姚勤;陳克平;李芒芒;徐五
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NS1蛋白的方法，其特征在于，構建攜帶有egfp表達盒和ns1基因表達盒的供體質粒，用該供體質粒轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞，供體質粒序列上Tn7R-Tn7L之間的egfp表達盒和ns1基因表達盒可特異性轉座到Bm-Bacmid載體上，構建表達egfp和ns1基因的整合型重組真核表達載體，將其轉染昆蟲細胞后產生的重組芽生型BV病毒粒子感染家蠶，通過可視化的綠色熒光信號實時監測家蠶體內病毒增殖的情況。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的供體質粒通過下列步驟構建：(1)以家蠶桿狀病毒BmNPV基因組為模板，通過IE1-F/IE1-R擴增得到一個560bp的DNA片段，對擴增產物進行SnaB?I和BamH?I雙酶切，將酶切后的回收產物與經過同樣雙酶切的質粒pFastHTB進行連接，產生重組質粒pFastHTB-P_ie1；(2)以EGFP-F和EGFP-R，從pMD18T-egfp質粒中擴增得到720bp的egfp基因全長，對該擴增產物進行BamH?I/?Kpn?I雙酶切，將酶切回收后的DNA片段與經同樣雙酶切的pFastHTB-P_ie1進行連接，得到重組質粒pFastHTB-P_ie1-egfp；(3)通過IE1-EGFP-SV40-F和IE1-EGFP-SV40-R，從pFastHTB-P_ie1-egfp擴增得到1544bp的egfp表達盒：P_ie1-egfp-sv40，對P_ie1-egfp-sv40進行EcoR?I/SnaB?I雙酶切，將酶切后的回收產物與經過同樣雙酶切的pFastBacI進行連接，得到(4)以Pph-F和Pph-R為引物，從pFastHTB質粒中特異性的擴增232bp的P_polh-6×His-TEV序列，對擴增產物進行Spe?I和Xba?I進行雙酶切，將酶切回收產物與經同樣雙酶切的進行連接，得到(5)通過ns1-F和ns1-R從pMD18T-ns1質粒中擴增得到951bp的ns1基因，對擴增得到的ns1基因進行Nhe?I(與Xba?I互為同尾酶)和Xho?I雙酶切，對回收后的DNA片段與經過Xba?I和Xho?I酶切的進行連接，得到由于該質粒在ns1基因下游同樣具有一個加尾信號sv40序列，因此把該質粒命名為