[發明專利]一種馬流產沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310298849.7
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103484537A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 蘇艷;邵俊高;楊康;張寶江
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種可用于檢測馬流產沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，具體內容是利用試劑盒中自行設計的特異引物，結合PCR檢測方法檢測馬流產沙門菌，為馬流產沙門菌的檢測提供了一種特異、敏感、快速的方法。?

技術背景

馬副傷寒性流產是由馬流產沙門氏桿菌所引起的馬屬動物的一種慢性傳染病，在臨床上無明顯的全身癥狀，以孕馬突然流產為特征。該病廣泛地分布于世界各國，在歐洲18-19世紀大批流行，1893年由Smith和hlome發現本菌后，在世界各地均發現此病。渡部氏于1939年曾報告在內蒙海拉爾地區某些馬場中發現本病，1958年河北省壩上地區某些馬場中亦有發生。1959和1963年察北牧場流產80余匹，流產率分別達53％以上。?

準確而快速的診斷是控制疾病的關鍵，在疾病暴發時顯得尤其重要。診斷的速度決定疾控響應的速度，而疾控響應的速度又決定疾病傳播的范圍、疾病控制的成敗和經濟損失的程度。在我國隨著養馬業的快速發展對馬流產的診斷也越來越受重視。?

馬流產沙門菌傳統的診斷方法主要依靠流產病原材料中病原微生物學分離、培養和生化試驗等進行鑒定。這種方法存在諸多局限性，如馬流產沙門菌在生化試驗時往往出現不一致現象，可靠性差。另外檢測周期長，一般至少需要7～14d才能做出結果，極不利于對患馬進行及時治療。此外一些養殖場特別是發展中國家的普遍使用抗生素使得檢測沙門氏菌較困難。?

隨著分子生物學技術的發展，許多新的分子生物學技術正在被用來進行馬流產沙門菌的分離鑒定。最近幾年出現了一些新的檢測方法，如：膠乳凝集反應，酶聯免疫吸附試驗，免疫熒光試驗、和DNA雜交試驗。這些方法雖然快速但特異性差，且免疫方法檢測沙門氏菌的檢出率較低，從而限制了它們的推廣和應用。?

PCR技術近年來在檢測沙門氏菌方面得到了廣泛的應用，其具有敏感性高、特異性強、快速、簡便、能高通量檢測、重復性好等突出優點。總之PCR技術的應用很大程度上彌補了傳統鑒定方法的弊端。PCR法已被證明可為檢測沙門氏菌提供一個新方法。PCR診斷方法與傳統的形態染色、培養特性和生化鑒定方法相比較，能夠提高檢測靈敏度、縮短檢測時間、簡化檢測程序，實現檢測的自動化、快速化、特異化，在沙門氏菌的臨床診斷中具有重要的?應用價值。?

國內目前對馬流產沙門氏菌的研究較少，診斷也主要依靠傳統的分離、培養和生化試驗等進行鑒定，這些方法過程復雜，周期長，所需試劑繁多，可靠性差。目前PCR技術在檢測馬流產沙門氏菌方面的研究和應用還尚未見報道。?

發明目的?

針對目前國內馬業快速發展及馬流產沙門菌病診斷和研究中對于快速簡便診斷方法的需求，本發明提供了一種馬流產沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法。根據已發表的馬流產沙門菌基因序列，設計合成引物，擴增得到了1300bp的基因產物。該PCR診斷方法與傳統的形態染色、培養特性和生化鑒定方法相比較，具有快速、準確的優點，并且具特異性好，靈敏度高，在該病的臨床診斷中具有重要的應用價值。?

發明內容

本發明建立的馬鏈球菌馬亞種PCR診斷方法具有以下特征：?

(1)自行設計的鑒定引物，利用PCR方法擴增基因片段，擴增引物正向引物為上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCGT3’???下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC3’經該引物的擴增應得到1300bp的條帶。?

(2)對被檢細菌的基因組的PCR擴增。?

將提取馬流產沙門菌基因組DNA，經PCR擴增后，得到1300bp的條帶，與預期目的片段大小相符。?

(3)對建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的敏感性檢測。?

提取細菌的基因組DNA，進行5倍梯度稀釋，對提取各稀釋度基因組DNA按最適條件進行PCR反應，以確定本方法對該菌的檢測限。?

(4)建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的特異性的檢測。?

利用所建立的馬流產沙門氏菌PCR方法擴增經煮沸法提取的試驗菌株的基因組DNA，驗證本方法的特異性。?

發明效果?

(1)與傳統和現有的方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有操作簡便的特點。?

(2)與傳統和現有的方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有檢測速度快的優點。?

(3)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有靈敏度高的特點。?

(4)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有特異性強的特點，非常適用于馬流產沙門氏菌的準確的檢測與診斷。?

附圖說明