[發明專利]一種含凝血酶切割位點GST膜型表達載體及轉染陽性細胞的方法

有效

• 申請號: 201310298819.6
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103388001A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 張圓;莊然;李琦;張赟;金伯泉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 徐文權

技術領域

本發明屬于細胞轉染技術領域，涉及一種含凝血酶切割位點GST膜型表達載體及轉染陽性細胞的方法。

背景技術

在現代生命科學研究中，為了探尋某一特定基因的功能，往往需要在真核細胞中過表達該基因編碼的蛋白產物；或者利用過表達某一蛋白分子來改變真核細胞的生物學狀態，以研究細胞的功能；又或是大規模培養真核細胞以生產特定的蛋白產物。在這種情況下，最為常用的技術手段是利用質粒或病毒載體將外源基因導入宿主細胞，使外源基因在宿主細胞中擴增、轉錄、翻譯出蛋白產物。該項技術有一個關鍵的瓶頸問題，就是轉染效率低下，其后果就是轉染處理的細胞群中，只有一部分表達外源性目的基因，同時還有相當多的細胞不表達外源基因，兩者比例隨細胞系和轉染試劑的不同而不同。轉染效率是進行實驗設計時必須要考慮的關鍵問題。由于效率不是百分之百，轉染后大量野生型的細胞不表達外源基因，這樣的異質性細胞群體不能用于研究外源基因對細胞功能的影響。因此，基因轉染后從數量巨大的細胞群中檢測并分選出轉染陽性細胞，就成為該類實驗研究的關鍵步驟。

目前，解決這一技術瓶頸常用的方法主要集中于三個領域：

一、研究開發新的轉染試劑，提高轉染效率。國際上多家知名的大型生物技術公司均推出了各自的轉染試劑，例如Invitrogen公司的lipefectamin系列產品，Roche公司的X-tremeGENE系列產品，Qiagen公司的Activated?dendrimers技術等等。盡管技術各自不同，但是轉染效率達不到百分之百是相同的。其它如電穿孔等技術方法同樣也有難以解決的技術難題，突出問題就是細胞存活率低下，后續實驗技術要求高。

二、在真核表達載體中插入特定藥物的抗性基因，轉染細胞后在培養基中加入細胞毒性藥物，利用選擇壓力進行篩選。例如，氨基糖苷類抗生素新霉素及其類似物G418可以通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成殺死真核細胞。多種真核表達載體中具有新霉素抗性基因（neo^r），其編碼的蛋白產物氨基糖苷磷酸轉移酶能夠分解新霉素和G418，轉染了目的載體的陽性細胞表達抗性基因，從而能在含有G418的選擇性培養基中生長，而未轉染的陰性細胞則被G418選擇性殺死。通過一定時間的篩選培養，最終獲得較高純度的轉染陽性細胞。與此原理類似的還有Zeocin抗性選擇、Hygromycine抗性選擇、Puromycine抗性選擇等。

這一技術目的在于去除未導入質粒的野生型細胞，擴大基因轉染技術的應用范圍，但仍存在不足之處。具體說來，因為轉染后具有細胞毒性的抗生素在不能在短時間內有效的殺死未轉染的野生型細胞，所以該方案主要用于獲得可以長期表達目的基因的穩定細胞株。一般而言，質粒的抗性基因與目的基因分別屬于不同啟動子控制下的兩個轉錄本，其整合到宿主細胞基因組的過程是隨機、非定點的。這樣，外源性目的基因和抗性基因的整合、表達均是不可控的。

為了維持轉染細胞持續表達外源基因的陽性表型，通常的方案是在培養基中持續添加篩選用的抗生素，這在一定程度上增加了實驗成本。而且，更為重要的是，轉染陽性細胞經過長時間培養，在外源抗生素這種單一生存壓力持續存在的情況下，最終存活并得以大量增殖的細胞是對該種抗生素具有最大抵抗活性的細胞，而實驗的根本目的是研究外源性目的基因表達陽性的細胞，兩者南轅北轍，這一狀況必將大大影響實驗結果的科學性和可靠性。這種方案既耗時效率又低，要分選出表達了目的基因的細胞株通常需耗費一個甚至幾個月的時間，而最終獲得的細胞株很有可能仍然是異質性細胞群。所以往往還需要進一步的表型篩選，這一步驟涉及PCR、Western?blot、單一細胞克隆化培養等操作，工作量極大。

三、轉染陽性細胞的機械性分選技術。例如：流式細胞儀分選，該技術可以利用特異性抗體的免疫熒光染色分選出不同亞群的原代細胞，例如利用熒光標記的抗CD3單克隆抗體可以從外周血樣本中高純度的分選出T細胞。同樣也可以利用轉染細胞所獲得的某些新特性（如新的膜表面分子特異性染色或表達外源性熒光蛋白），通過流式細胞術來進行分選轉染陽性細胞。但是，流式分選技術依賴于大型儀器設備，所需費用高，無菌環境要求高，對操作人員的技術要求高，且對處理細胞有一定的損傷，使其推廣應用受到限制。而且，該方案局限于只能分選細胞膜表面表達外源目的基因的情況。如果外源基因是胞內或者核內定位表達，則無法利用免疫熒光染色的方法分選。