[發明專利]一種熱穩定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突變體V81P/G82E及其基因和應用有效

申請號：	201310298293.1	申請日：	2013-07-16
公開（公告）號：	CN103343113A	公開（公告）日：	2013-10-09
發明（設計）人：	姚斌;羅會穎;王坤;王亞茹;孟昆;石鵬君;黃火清;柏映國;楊培龍;趙珩;馬銳	申請（專利權）人：	中國農業科學院飼料研究所
主分類號：	C12N9/42	分類號：	C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種熱穩定性改良聚糖 xynas9 突變體 v81p g82e 及其基因應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體內容涉及一種熱穩定性改良的木聚糖酶突變體XynAS9-mV81P/G82E及其基因和應用。

背景技術

木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanases，EC3.2.1.8)是一類重要的工業用酶，降解木聚糖成低聚糖和木糖的一類酶的總稱。主要以內切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-糖苷鍵，生成低聚木糖和木糖，是半纖維素水解酶系中最關鍵的水解酶之一，目前所克隆的木聚糖酶大多屬于F/10和G/11家族，且第十家族的木聚糖酶較第十一家族的木聚糖酶具有底物特異性低、水解速度快、水解產物聚合度低等優勢，因此在工業上具有重要的應用價值。近幾年來木聚糖酶已經在飼料、制漿造紙、食品、能源等行業中得到廣泛應用，尤其是在工業造紙上的應用。但是目前大多木聚糖酶的最適溫度為45-55℃，且熱穩定性差，不能滿足紙漿釀造中的要求，并且高溫木聚糖酶或耐熱酶具有降低酶制劑的成本，提高反應催化效率，降低反應能耗，降低了雜菌的污染及對化學變性劑及相關金屬利息具有較高的耐受力。基于此尋找有效途徑和手段，提高木聚糖酶在高溫環境中的穩定性及催化活性已成為國內木聚糖酶工業的當務之急。

隨著蛋白質工程技術和分子生物學的發展，運用定向進化和理性設計的手段對酶分子進行人工進化和改造已成為當前酶工程領域研究的熱點。到目前為止，已有許多學者運用這項技術成功對蛋白的熱穩定性進行了改造，本發明應用定點突變的方法改造木聚糖酶，分別獲得木聚糖酶XynAS9-m突變體V81P/G82E和木聚糖酶XynAS9-m突變體V81P/G82E/D185P/S186E，將木聚糖酶XynAS9-m的最適溫度提高了20℃，Tm值提高了7℃，擴大了其在工業上的應用。

發明內容

本發明的目的是通過定點突變的方法對木聚糖酶進行改造，使改造后的木聚糖酶XynAS9-m突變體在耐受性上性質更加優良。

本發明的另一目的是提供編碼上述木聚糖酶XynAS9-m突變體的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述木聚糖酶XynAS9-m突變體基因的重組載體。

本發明還提供了一種宿主細胞，其含有如前所述的木聚糖酶XynAS9-m突變體的基因或如前所述的重組載體。

本發明對鏈霉菌來源的木聚糖酶XynAS9-m基因進行定點突變，該木聚糖酶的成熟蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列，該成熟蛋白是由如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列編碼的。

SEQ?ID?NO.1

1????MFRHHPTRGR?RTAGLLAAAL?ATLSAGLTAV?APAHPARADT?ATLGELAEAK

51???GRYFGSATDN?PELPDTQYTQ?ILGSEFSQIT?VGNTMKWQYT?EPSRGRFDYT

101??AAEEIVDLAE?SNGQSVRGHT?LVWHNQLPSW?VDDVPAGELL?GVMRDHITHE

151??VDHFKGRLIH?WDVVNEAFEE?DGSRRQSVFQ?QKIGDSYIAE?AFKAARAADP

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