[發明專利]一種高效獲得春蘭脫毒幼苗的方法

有效

• 申請號: 201310297453.0
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103314862A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 葛建
• 申請（專利權）人: 葛建
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

技術領域

本發明涉及一種高效獲得春蘭脫毒幼苗的方法，具體涉及一種通過外植體脫分化、再分化高效獲得春蘭脫毒幼苗的方法。

背景介紹

春蘭是中國蘭花種系中一個重要的品種，春蘭是地生蘭常見的原種，一般生活在溫帶，在江浙一帶種植較為廣泛，春蘭開花時有特殊的香氣、花色豐富，花期一般2-4個月，形態秀麗，常作為盆栽，為室內布置之佳品，其根、葉、花均可入藥，具有較高的觀賞價值和藥用價。

春蘭的繁殖技術主要由三種，分株繁殖、種子繁殖和組織培養繁殖，分株繁殖速度非常慢，并且繁殖率低，周期長，易傷及母株；春蘭種子極細，在自然條件下發芽率極低，很難滿足規?；a的需要。通過組織培養獲得春蘭幼苗目前越來越多被人們應用，例如申請號為CN201010127788.4的中國專利公開了“一種春蘭種苗繁殖方法”，通過調整激素的濃度和根菌真菌的共生培養，有效利用蘭科植物菌根共生促進生長的特點，縮短蘭科植物組培苗的繁殖周期。真菌雖能夠促進春蘭生長，但真菌侵染春蘭根部，可能會對春蘭的品質造成一定的影響，因此需要尋找一條更好的春蘭組織培養方法。

發明內容

本發明的目的是針對上述春蘭在繁殖過程中遇到的種種問題，提供了一種高效獲得春蘭脫毒幼苗的方法。

為達到上述目的，本發明采取的技術方案為：一種高效獲得春蘭脫毒幼苗的方法，包括春蘭種子萌發、外植體選擇與消毒處理、原球莖誘導、原球莖的保存與再分化誘導以及幼苗馴化培養，其特征在于：具體步驟如下：

a、春蘭種子萌發?

選擇生活力較強的春蘭種子若干，種子放置在孔徑極細的聚丙烯篩網中，先用15%雙氧水進行消毒處理5min，取出后用無菌水反復沖洗3次，然后再利用0.1%升汞溶液處理2min，最后將種子放在75%酒精中消毒處理30s，處理后用無菌水反復沖洗3遍；

處理后的種子播撒在MF固體培養基中，后將播種有春蘭種子的培養基放在人工氣候培養箱中培養，培養條件為相對濕度為65%，23℃，1500lux光照12h/d處理，1.5月后春蘭種子萌發；

b、外植體選擇與消毒處理

待春蘭種子萌發后，生長到形成2個嫩葉后，在無菌操作環境中用解剖刀剪取春蘭幼苗的嫩芽尖、莖尖或者根尖，剪下的嫩芽尖、莖尖或者根尖放在0.1%升汞溶液處理20s，后將其放在75%酒精中消毒處理10s，再用無菌水反復沖洗3遍；

c、原球莖誘導

沖洗后在無菌環境中用剪刀將嫩芽尖、莖尖或者根尖剪成2mm2大小的片狀，加入到誘導原球莖培養基MY中，每個裝有50ml的原球莖培養基MY中放入12個外植體碎片，接種后放在人工氣候培養箱中培養，培養大約3個月后，培養基中出現黃色的球狀緊密的細胞團，該細胞團即為春蘭的胚性原球莖；所述誘導原球莖的培養條件為相對濕度為65%，23℃，200lux光照12h/d處理；

d、原球莖的保存

胚性原球莖形成后，將胚性原球莖取出放在干凈無菌的塑料培養皿中，在無菌條件下用解剖刀將胚性原球莖分切成1mm2大小的小塊，接種在原球莖保存培養基MB中培養，培養條件為濕度設定為65%，23℃，200lux光照12h/d處理，每隔120天轉接一次繼續傳代培養，提高原球莖的繁殖系數；所述原球莖保存培養基MB的配方同誘導原球莖形成培養基MY；

e、原球莖的再分化誘導

將胚性原球莖取出放在干凈無菌的塑料培養皿中，在無菌條件下用解剖刀將胚性原球莖分切成1mm2大小的小塊，接種在原球莖再分化誘導培養基MZ₁中誘導培養，大約培養3周左右，原球莖再分化形成新芽，然后再將形成新芽的原球莖轉移到MZ₂培養基中繼續培養，誘導培養形成新根，培養3周開始形成新根，培養條件為為溫度設定為65%，26℃，2000lux光照12h/d處理；

f、幼苗馴化培養

當幼苗株高長到4cm-6cm，具有5-6個根時，將植物組織培養瓶的無菌瓶蓋打開，將組織培養瓶從人工氣候培養箱中拿出放在光照培養架上培養，逐漸將室內恒溫空調關閉，連續馴化一周左右，然后將組培幼苗從組培瓶中移出，轉移到滅菌后的百合營養花卉培養土中，移至室外遮陽網下生長，處理1-2周后，將生長健壯的百合苗移栽到土壤中，定期澆水、施肥處理，關注植株的生長狀態。