[發明專利]一種煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201310297162.1
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103468794A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 賈蒙驁;陳興江;曹毅;陸寧;商勝華
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 趙彥棟

技術領域

本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治領域，具體涉及一種煙草青枯病病菌分子檢測引物、檢測方法及應用。

背景技術

煙草青枯病的病原為茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，桿狀，無莢膜，革蘭氏染色陰性。這種病原菌寄主范圍超過200個種，包括了許多重要的經濟作物，如番茄、馬鈴薯、煙草。因此，快速的早期診斷對于控制青枯病的發生蔓延以及重大損失的發生具有重要意義。

隨著基因組測序技術的發展和生物信息學數據的積累，多個Ralstoniasolanacearum菌株的基因組學列已經被公布，其中GMI1000菌株的測序結果公布最早，且注釋信息最詳細，已經成為其他菌株基因組研究的參考。在Ralstoniasolanacearum基因組編碼的眾多蛋白中，flic基因編碼鞭毛亞基蛋白(1)，N-端和C-非常保守，但是中間區域變異明顯，可以被用來作為不同菌種和不同菌株鑒定的依據。正因如此，flic基因常被作為高特異性、高靈敏性PCR檢測的目標基因（2）。

環介導的擴增首先由Notomi報道，這是一種極具前景的新方法，可以廣泛應用于病原微生物的快速檢測。這種方法需要一組引物，這組引物共6條，經過特殊設計，可是識別6個不同模板并能在Bst聚合酶大亞基作用下完成鏈取代式的DNA合成，原理核心?LAMP?的原理核心是針對靶基因?6?個區域設計的?6條特殊引物和具有鏈置換活性的Bst（Bacillus?stearothermophilus）DNA?聚合酶。在Bst?DNA?聚合酶最適溫度?60~65℃恒溫條件下，利用可以產生環狀結構的引物和Bst?DNA?聚合酶鏈置換合成的活性，在靶序列兩端引物結合處循環不斷地產生環狀單鏈結構，使得引物在等溫條件下引發新鏈合成，從而使靶基因高效擴增。反應產物既可以通過傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測，也可以直接加入SYBR?green染色劑，通過顏色變化肉眼識別。

目前煙草青枯病病原菌的檢測主要用的PCR檢測法，對專業儀器依賴重，并且檢測時間較長的確定，而本發明利用環式等溫擴增原理，為煙草青枯病病原菌的檢測設計了一套分子檢測引物，利用這套引物，通過環式等溫擴增反應，可以快速準確的完成煙草青枯菌的檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是現有技術中煙草青枯病病原菌的檢測主要用的PCR檢測法，對專業儀器依賴重，并且檢測時間較長，本發明提供一種基于環式等溫擴增原理的煙草青枯病分子檢測引物、檢測方法及應用，利用環式等溫擴增原理，為煙草青枯病病原菌的檢測設計了一套分子檢測引物，利用這套引物，通過環式等溫擴增反應，可以快速準確地完成煙草青枯菌的檢測。

本發明采用的技術方案：

本發明煙草青枯病病原菌分子檢測引物，?由上下游內引物、上下游外引物

和環引物組成，所述分子檢測引物的DNA序列為：

上游外引物（F3）：5’-AGCCGGAACAAGTATTCATC-3’

下游外引物（B3）：5’-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3’

上游內引物（FIP）：

5’-ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3’

下游內引物（BIP）：

5’-GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3’

環引物F（Loop?F）：5’-CGTTTGCAGGGACGAGAT-3’

環引物B（Loop?B）：5’-CGGTCTGCGTGTGAACAG-3’?。

本發明煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，?包括以下步驟：以提取的疑似感

病煙草總DNA為模板，利用上述的分子檢測引物進行環式等溫擴增，反應結束后，根據反應產物的顏色判定結果，反應產物為綠色的，即為煙草青枯病病原菌檢出。

更進一步，煙草青枯病病原菌分子的檢測方法，在25ul體系中，上游內引物