[發明專利]可調控ATXN3基因表達的SCA3/MJD分子標志物miRNAs的篩選和鑒定方法

有效

• 申請號: 201310297028.1
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103343167A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 江泓;黃鳳珍;張莉;師玉亭;唐北沙
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 李展明

1.可調控ATXN3基因表達的SCA3/MJD分子標志物miRNAs的篩選和鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）準備含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血各5~10ml，分離的血清分裝后置于-80℃備用；

（2）TRIzol法提取步驟（1）血清中含miRNA的總RNAs；

（3）應用miRNA微陣列芯片技術對步驟（2）中的總RNAs進行miRNAs表達譜檢測，初步篩選得到SCA3/MJD分子標志物miRNAs；

（4）對步驟（3）初步篩選得到的SCA3/MJD分子標志物miRNAs，應用生物信息學方法和qRT—PCR技術在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中進行驗證；

(5）上調通過步驟（4）驗證的SCA3/MJD分子標志物miRNAs，利用Western?blot技術檢測轉染所述SCA3/MJD分子標志物miRNAs后內源性野生型及外源性突變型ataxin-3蛋白表達水平：

①HEK?293T細胞培養；

②細胞轉染：

內源性ataxin-3蛋白檢測轉染成分：negative?mimics??100ng、?miR-29a?mimics?100ng、?miR-34b?mimics??100ng、miR-125b?mimics??100ng、?miR-25?mimics??100ng、?siATXN3??100ng；其轉染對象為HEK?293T細胞；

外源性ataxin-3蛋白檢測轉染成分：negative?mimics?100ng?、?siATXN3??100ng?、miR-25?mimics??100ng?；其轉染對象為SCA3/MJD模型細胞；

③內源性野生型及外源性突變型ataxin-3蛋白表達水平檢測：總蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAGE膠的制備，上樣及電泳，轉膜，封閉，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，顯影及定影；

（6）上調及下調步驟（5）明確的SCA3/MJD分子標志物miRNAs表達后，采用qRT-PCR法檢測內源性野生型及外源性突變型ATXN3基因mRNA表達水平；

①HEK?293T細胞或SCA3/MJD模型細胞培養；?

②細胞轉染：

內源性ATXN3基因表達測定：?siATXN3?50ng、?miR-25?mimics?50ng、negative?mimics?50ng、miR-25?inhibitor?100ng、negative?inhibitor?100ng、空轉染組；其轉染對象為HEK?293T細胞；

外源性ATXN3基因表達測定：negative?mimics?50ng、siATXN3?50ng、miR-25?mimics?50ng；其轉染對象為SCA3/MJD模型細胞；

③內源性野生型及外源性突變型ATXN3基因mRNA表達水平檢測：

a)總RNAs抽提；

b)總RNAs純度鑒定；

c)總RNAs完整性鑒定；

d）逆轉錄合成cDNA；

e）qRT-PCR：以β-actin作為內參照，

cDNA序列引物：

?ATXN3-1F:?GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG?；

ATXN3-2R:?TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG；β-actin-1F:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG?；

β-actin-2R:?GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC；

f)?通過比較目的基因ATXN3和內參基因β-actin的Ct值，應用2?-^△△?Ct法對所得數據進行處理，計算目的基因ATXN3相對內參基因β-actin的mRNA相對表達量；

（7）應用雙熒光素酶報告基因檢測技術明確SCA3/MJD分子標志物miRNAs調控ATXN3基因的作用靶點；

①生物信息學軟件預測調控ATXN3表達的miRNA；?

②構建及鑒定ATXN3基因3’UTR部分序列熒光素酶報告基因表達載體；

③構建及鑒定ATXN3基因3’UTR部分序列熒光素酶報告基因表達突變體；

④雙熒光素酶報告基因活性檢測：

a)HEK?293T細胞培養；

b)細胞轉染：

pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR轉染組：?pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR??150ng+miR-25?mimics??25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR??150ng+negative?mimics??25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR??150ng；

pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR轉染組：pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR???150ng+miR-25?mimics??25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR??150ng+negative?mimics??25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR??150ng；

c)雙熒光素酶活性分析。