[發明專利]一種廣譜抗菌多肽的制備方法

有效

• 申請號: 201310296766.4
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103360467A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 盧永忠;莊玉;劉杰
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;A61P31/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種廣譜抗菌多肽的制備方法，屬于生物化學和生物技術領域。

背景技術

抗生素的耐藥性已成為影響抗感染治療和畜牧業發展的嚴重問題，新的抗菌物質的研究和開發是解決這一問題的關鍵。抗菌肽作為一種重要的抗菌物質，近年來成為研究的熱點。抗菌肽是一種具有抗菌活性的短肽，由細胞特定基因編碼、經外界條件誘導產生，廣泛存在于生物界，是天然免疫系統的重要組成部分。許多抗菌肽除了有抗菌作用外，還表現出抗病毒、抗腫瘤的活性。抗菌肽一般是陽離子兩親結構，能夠特異地與帶負電的細胞結合，在細胞膜上形成小孔，或破壞細胞膜結構，導致細胞死亡。其作用機理獨特，不易產生耐藥性；在抗腫瘤方面，許多抗菌肽具有選擇性殺傷腫瘤細胞的功能，尤其是對哺乳動物正常細胞毒性較低，有望成為人類戰勝癌癥的新式武器，已經成為抗腫瘤藥物研發的熱點之一。許多具有抗腫瘤活性的抗菌肽已進行臨床實驗，因此抗菌肽極具開發利用價值。

自1980年第一種抗菌肽天蠶素分離以來，從細菌、真菌、昆蟲、兩棲類、高等植物及哺乳動物中相繼發現并獲得了許多具有類似性質的活性多肽。隨著新技術、新方法的應用，新發現的抗菌肽數量還在持續增長。傳統的抗菌肽篩選技術多依據蛋白質分離純化方法進行逐級分離，并在分離的過程中檢測各組分的抗菌活性。另外一種思路是從分離抗菌肽基因入手，再通過化學合成或基因工程的方法獲得抗菌肽。從基因分離的角度進行抗菌肽的篩選和分離，是利用了已知抗菌肽的結構和功能的信息，在效率上更高一些。以上方法各有優缺點。雖然抗菌肽的種類和制備方法很多，但仍然需要研發更新、更具應用價值的廣譜抗菌多肽。

發明內容

本發明的目的在于解決上述技術中的不足，提供一種具有抗多種革蘭氏陽性菌、陰性菌的長效、耐熱、無溶血性的新的廣譜抗菌多肽的制備方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術手段是：一種廣譜抗菌多肽的制備方法，其步驟包括：

一、預測篩選：下載海鞘的基因組序列，尋找其中具有潛在編碼功能的小開放閱讀框，將這些小開放閱讀框分別翻譯出對應的氨基酸序列，從中篩選抗菌肽；

二、制備抗菌肽：根據步驟一中預測篩選的抗菌肽序列，利用固相合成法合成其中的部分多肽，并且使C端酰胺化，N端不含有蛋氨酸，制備抗菌肽，并進行質譜鑒定；

三、抗菌性檢測：將抗菌肽用蒸餾水溶解成濃度為1mg/ml，采用瓊脂糖擴散法進行抗菌活性檢測；

四、溶血性檢測：利用羊血紅細胞檢測抗菌肽的溶血作用；

五、制備廣譜抗菌多肽：最終篩選到的具有廣譜抗菌功能的多肽。

進一步的，所述步驟三中瓊脂糖擴散法中使用的菌株為大腸桿菌、金黃葡萄球菌、四聯球菌、白色假絲酵母、變形桿菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌、幽門螺桿菌的一種或幾種組合。

進一步的，所述步驟五中制備的多肽，其序列為：Phe?Ser?Leu?Phe?Phe?Pro?Tyr?Ala?Ala?Leu?Lys?Trp?Leu?Arg?Lys?Leu?Leu?Lys?Lys。

進一步的，所述步驟五中制備的多肽尤其對變異鏈球菌、幽門螺桿菌具有殺傷作用。

本發明的有益效果在于：本方法制備的多肽具有廣譜的抗菌作用，尤其是對變異鏈球菌、幽門螺桿菌具有殺傷作用，而對正常細胞沒有副作用；分子量小，結構簡單，人工合成方便；作用持久，無溶血作用，顯示其在治療細菌性感染，特別是對變異鏈球菌、幽門螺桿菌感染的治療方面具有重要應用價值。

具體實施方式

實施例1

一種廣譜抗菌多肽的制備方法，其步驟包括：

一、抗菌肽的生物信息學篩選?

以海鞘2號染色體基因組序列為模板，根據抗菌肽分子量小的特點，首先利用小開放閱讀框分析軟件sORFfinder從基因組序列中篩選具有潛在編碼功能的小開放閱讀框(sORFs)。將這些sORFs分別翻譯出對應的氨基酸序列，利用抗菌肽預測軟件CAMP從sORFs中篩選抗菌肽。共預測到可能性超過70%的序列100余條。

二、多肽的抗菌活性鑒定

選擇8個可能性超過90%、2個可能性在60-70%之間的序列，委托上海楚肽生物技術公司利用固相合成法合成，并將C末端酰胺化，合成后經HPLC純化，純度達到96.68%，并經質譜分析鑒定（表1）。

表1?合成多肽序列表