[發明專利]一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法

無效

• 申請號: 201310296262.2
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103320521A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 王師;于杰;張玲玲;包振民
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 王曉曉

1.一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）采集浮游植物樣品；

（2）提取浮游植物基因組總DNA；

（3）18S?rDNA可變區V9區的PCR擴增及優化：

18S?rDNA可變區V9正向引物V9F：5'磷酸化-CCCTGCC(A/T/C)TTTGTACACAC-3';

18S?rDNA可變區V9反向引物V9R：5'磷酸化-CCTTC(C/T)GCAGGTTCACCTAC-3';

PCR擴增體系：總體系為40?μl，包括1×Phusion?HF?Buffer、0.2?mM?dNTPs、0.5?μM引物V9F、0.5?μM引物V9R、0.625-2.5?ng/μl基因組總DNA、0.8?U?Phusion?超保真DNA?聚合酶；

PCR反應條件：98℃預變性30s；98℃變性10s、53-58℃退火30s、72℃延伸20s?，16-25個循環；最后72℃延伸10?min；

PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后在凝膠成像系統中進行分析；

（4）Illumina測序平臺上機樣品的制備：

a、純化步驟（3）所得的PCR產物；

b、PCR產物末端加A，進行PCR：32?μl反應體系中包括：步驟a純化后的產物500?ng、2?U?Taq酶、0.2?mM?dATP、1×Taq?Buffer、1.4?mM?MgCl2，72℃反應20?min；

c、純化步驟b的PCR反應產物；

d、接頭連接：

接頭序列:?Adapter-1：5'磷酸化-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'；

接頭序列:?Adapter-2：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

20μl反應體系包括：步驟c純化后產物12?μl、1.5?μM接頭、1×Quick?Ligation?Buffer和2?μl?Quick?T4?DNA連接酶（NEB），20℃反應30?min；

e、PCR引入barcode序列:

Primer-1：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

Primer-2：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；

Index?Primer序列：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3'；

40μl反應體系中包括：步驟d的連接產物2?μl、1×Phusion?HF?Buffer、0.2?mM?dNTPs、0.5?μM?Primer-1、0.01?μM?Primer-2、0.5?μM?Index?Primer、0.8?U?Phusion超保真?DNA?聚合酶；

PCR反應條件：98℃預變性30s；98℃變性10s、65℃退火30s、72℃延伸20s?，10-20個循環；最后72℃延伸10?min；

f、回收步驟e所得PCR產物；

（5）采用Illumina測序平臺對所得產物進行雙末端100bp測序；

（6）數據分析。

2.根據權利要求1所述的一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）中先采用20?μm微孔濾膜過濾，再用2?μm微孔濾膜過濾收集微型浮游植物。

3.根據權利要求1所述的一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100V、時間25?min，浸入2%的溴化乙錠中染色10?min，然后在凝膠成像系統中進行分析。

4.根據權利要求3所述的一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR擴增體系中1.25?ng/μl為最適模板濃度。

5.根據權利要求3所述的一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR反應條件中20個循環為最適循環數。

6.根據權利要求3所述的一種真核浮游植物多樣性的快速高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR反應條件中55℃為最適退火溫度。