[發明專利]蛋白質分離純化的方法及回收裝置

有效

• 申請號: 201310296231.7
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN104292296B
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 王星
• 申請（專利權）人: 淄博云橋生物技術有限公司
• 主分類號: C07K1/26
• 分類號: C07K1/26;C07K1/28;C07K1/34;C07K1/24
• 代理公司: 青島發思特專利商標代理有限公司37212
• 代理人: 耿霞

技術領域

本發明屬于蛋白質分離純化領域，具體涉及一種蛋白質分離純化的方法及回收裝置。

背景技術

在蛋白質的生物化學研究中，電泳可以根據不同的電荷差異（在沒有變性的凝膠電泳中）或者蛋白質的分子量的大小（在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）將蛋白混合物分離而成為不同蛋白條帶。在一維凝膠電泳中，變性凝膠電泳的主要用途是從凝膠中檢測和定位蛋白質，同時也可以用來從混合物中進一步分離純化蛋白質。一維凝膠電泳中使用最廣泛的是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。在典型的SDS-PAGE中，樣品用還原劑β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)和高濃度的SDS(2%)進行處理。還原劑可以使由二硫鍵連接起來的蛋白質分解，SDS將結合到蛋白質基團上。經過這些處理，蛋白質將按照其分子量在電場中移動。同非變性凝膠電泳相比，SDS-PAGE有更高的分辨率，更重要的是提供了一個可靠的方法來判斷蛋白質分子量的大小。雖然SDS-PAGE和非變性凝膠電泳已經廣泛的應用于生物化學研究，但是它們有幾個不同點。首先，非變性凝膠電泳分辨率比較低，從而限制了它的使用。其次，在收集活性蛋白質和研究蛋白質的催化性能的試驗中，因為蛋白質都被固定到聚丙烯酰胺凝膠中，所以蛋白質在凝膠中的催化效率不如在溶液狀態下高。第三，因為許多蛋白質在通常條件下是以聚合體的形式存在，所以在非變性凝膠電泳中很難評價單個蛋白質的性能。換句話說，SDS-PAGE提供了一個更好的純化蛋白質的方法，但是如果需要觀察離散的蛋白條帶，電泳過程仍然僅限于部分純化蛋白質的制備。如果從微生物、植物或動物中制備一種蛋白質，那么樣品中就有成千上萬種蛋白質，所以幾乎不可能將如此多的蛋白質通過SDS-PAGE分離成離散的條帶并純化出來。此外，在SDS-PAGE中蛋白質樣品的處理第一步通常是使蛋白質變性。樣品的處理過程通常是添加高濃度的還原劑和去污劑，并在100℃下水浴5分鐘。大多數蛋白質在這些條件下會變性，這樣會使我們感興趣的蛋白質的功能鑒定變的非常困難。因此非變性凝膠電泳和SDS-PAGE都不適合從蛋白質混合物中直接對蛋白質進行純化和功能鑒定。

二維凝膠電泳(Two Dimensional Gel Electrophoresis,2-DE)起源于上世紀70年代。在二維凝膠電泳中，蛋白質從兩個維度進行分離。在第一個維度蛋白質按照其等電點分離。蛋白質混合物在電場中被施加一個pH梯度，蛋白質移動到與它們電荷相符的位置，此處它們的電荷為零（等電點）；在第二個維度，蛋白質按照它們的分子量進行分離。通常的一維SDS-PAGE的過程與此相似。因為第一維度和第二維度的分離參數彼此不同，二維電泳相對于一維電泳在分離蛋白質方面有較高的分辨率。雖然利用二維電泳技術不能從細胞粗提液中分離所有蛋白質，但是二維電泳已經是眾所周知的最有效、最簡單的分離技術。經過多年的改進，二維電泳已經發展成為一個在分析復雜生物系統方面強有力的工具，尤其是當每個凝膠的二維電泳的分辨率超過10000種蛋白質時它的優勢更為明顯。二維電泳另一個主要的進步是固定化pH梯度凝膠的發明，這個固定化pH梯度凝膠提供了一種高分辨率的分離方法，更重要的是固定化pH梯度凝膠具有高度可重復性。當前二維電泳分離的蛋白質可以通過微量測序、質譜或者二者結合的方式對蛋白質進行鑒定。二維電泳在生命科學研究中的重要性表現為以下幾個方面。首先，它提供了一個在確定的生理階段和條件下的生物體相對完整的生物化學圖像，特別是基因表達相對比較高的蛋白質都能在二維電泳中進行分析。這在系統生物學研究中非常有用，因為我們知道基因表達和蛋白質表達沒有明顯的關聯，而蛋白質的表達更能反映生物體內的生物化學狀態。產生這種基因表達和蛋白質表達沒有明顯關聯現象的原因是復雜的，但其中有許多明顯的原因如mRNA轉錄、個體基因啟動子的強度和蛋白質合成的相對穩定性等。其次，二維電泳有助于對蛋白質翻譯后修飾的系統研究。蛋白質的修飾是對生物體基因轉錄調控的補充，而且這些蛋白質是直接參與保證生物體正確運轉的體內組分。