[發明專利]用于人乳頭瘤病毒16基因檢測的生物試劑

有效

• 申請號: 201310294133.X
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103540682A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 鐘建;方平科
• 申請（專利權）人: 鐘建
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京攀騰專利代理事務所(普通合伙) 11374
• 代理人: 彭蓉

1.一種用于人乳頭瘤病毒16（HPV16）基因檢測的試劑盒，其包括DNA提取液，HPV16PCR反應液，HPV16強陽性質控品和陰性質控品，其中：

所述HPV16PCR反應液包括超純水，緩沖液，dNTP，引物16F1和16R1，以及探針16P1；

所述引物16F1的序列為TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA，所述引物16R1的序列為TGTCCAACTGCAAGTAGTCTGGAT，所述探針16P1的序列為FAM-CACGGATGAATATGTTGCAC-MGB?NFQ。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括：DNA提取液2管；HPV16PCR反應液20管；HPV16強陽性質控品1管；陰性質控品1管。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括：DNA提取液2管，500μl/管；HPV16PCR反應液20管，19μl/管；HPV16強陽性質控品1管，200μl/管；陰性質控品1管，150μl/管；其中，所述HPV16PCR反應液包括超純水14.3μl，10×buffer緩沖液2μl，d?NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探針16P10.4μl。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成，并且根據HPV的不同分型而設計。

5.用于制備權利要求1所述的試劑盒的方法，其包括下述步驟：

1）確定待測基因片段：根據科技文獻的方向性報道初步選定候選基因片斷，然后經研發過程中與待檢樣本病理相關性的比較，最終確認與臨床疾病最具相關性的待測基因片斷；

2）根據所述待測基因片段設計并生產引物和探針，采用多核苷酸合成儀生產所述引物；

3）提取細胞基因組DNA：用DNA提取液提取病人基因組及對照組基因組DNA；

4）確定PCR擴增條件，其包括酶、探針、引物、基因組DNA用量及PCR的擴增條件：不同組合的引物片斷，根據實驗結果的特異性，敏感性等技術特征，反復試驗，同時進行多條所述待測基因片斷的檢測反應，最終確定包括所述引物、探針最佳濃度及酶的最佳反應條件，其中，PCR基因擴增的結果由熒光PCR儀來檢測；

5）進行重復性檢測以進一步確定反應條件：通過大量實驗，反復比較實驗結果中包括清晰度和靈敏性的因素，最終確定反應條件；

6）根據最終確定的所述反應條件，制備試劑盒，其組分包括：引物、探針、dNTP、10×buffer緩沖液、Taq聚合酶、試驗標準品、陰性質控品和超純水。

6.采用權利要求1所述的試劑盒進行HPV基因檢測的方法，其包括：

以用基因組提取試劑盒提取的患者的細胞基因組DNA為模板，用試劑盒提供的引物、探針、dNTP、酶、試劑標準品等組分，20μL反應體系，按照特定的比例分別加入；

采用PCR基因擴增技術，進行PCR反應，實現對HPV的基因檢測；

PCR結束后，采用瓊脂糖專用電泳儀進行電泳、EB染色、成像并進行基因分型，從而實現對HPV的基因檢測。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其中所述PCR反應進一步包括：

在0.2mL的PCR管里面，加入患者模板（50ng/μl），瞬時離心混勻后放入PCR儀中，在設定的PCR反應體系和擴增程序條件下獲得針對正常對照組和感染HPV16基因擴增的對照結果。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其中所述PCR反應體系和反應條件包括：

PCR反應體系（20μl），包括：HPV16PCR反應液18μl，模板2μl；其中PCR反應液的配置：超純水14.3μl，10×buffer2μl，d?NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探針16P10.4μl；

擴增程序，包括：60°C30s→95°C2min→95°C15s→60°C1min（共40個循環）。