[發(fā)明專(zhuān)利]一種通過(guò)轉(zhuǎn)化大豆毛狀根鑒定抗蚜基因抗性功能的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310294099.6
• 申請(qǐng)日: 2013-07-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103340180A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘云鵬;程琳靜;閆軍輝;王彪;武天龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A01K67/033
• 分類(lèi)號(hào): A01K67/033;A01H4/00
• 代理公司: 上海旭誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 田嘉嘉;鄭立

1.一種鑒定大豆抗蚜基因的方法，包括如下步驟：

1）獲得大豆子葉；

2）侵染轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根

3）除菌并繼續(xù)培養(yǎng)；

4）毛狀根接蚜；

5）抗蚜功能鑒定；

所述步驟1）中，所述大豆子葉為感蚜蟲(chóng)大豆種子萌發(fā)5～7天后形成的子葉。

所述步驟2）中，所述“侵染轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根”，是指采用攜帶有待鑒定基因的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染所述大豆子葉，并誘導(dǎo)毛狀根長(zhǎng)出。

2.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟1）中，獲得大豆子葉的方法為：挑選健康無(wú)病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干凈，體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒30～60秒，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%的Ca(ClO)₂消毒20～30分鐘，期間搖晃5～7次左右，無(wú)菌水洗去Ca(ClO)₂殘留，沖洗5～8次，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中，進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，無(wú)菌萌發(fā)5～7天后得所述大豆子葉。

3.如權(quán)利要求2所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為，光照16h/天，25±3℃；萌發(fā)培養(yǎng)基的成分為，MSB+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值為5.8。

4.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟2）中，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根的方法為：將子葉從下胚軸切下，在子葉近胚軸處，遠(yuǎn)軸心面切一傷口，傷口深至中軸，但不穿破子葉，將切好的子葉放在內(nèi)附濾紙的培養(yǎng)皿中，并滴加1/4MSB5液體培養(yǎng)基，使濾紙完全濕潤(rùn)但無(wú)剩余，在子葉的傷口處滴加20μL發(fā)根農(nóng)桿菌箘液，封口膜封住培養(yǎng)皿，暗培養(yǎng)3～5天后恢復(fù)光照培養(yǎng)，光照16h/天，25±3℃，培養(yǎng)1～2周，產(chǎn)生毛狀根。

5.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟3）中，除菌并繼續(xù)培養(yǎng)的方法為：將毛狀根切下，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含噻孢霉素的無(wú)菌水沖洗3～5遍，除菌后繼續(xù)培養(yǎng)。

6.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟3）中，所述除菌后繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/4MSB5+Cef500mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為3～5天。

7.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

步驟4）中，毛狀根接蚜的方法為：將大豆蚜蟲(chóng)接種到毛狀根上，每個(gè)培養(yǎng)皿接蚜蟲(chóng)3-5頭。

8.如權(quán)利要求7所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟4）中，所述大豆蚜蟲(chóng)為在感蚜大豆品種的離體葉片上培養(yǎng)的均一化的3齡大豆蚜蟲(chóng)，所述大豆蚜蟲(chóng)的繁殖是在感蚜大豆品種的離體葉片上進(jìn)行的。

9.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步驟5）中，抗蚜功能鑒定的方法為：以大豆蚜蟲(chóng)的平均相對(duì)生長(zhǎng)速率和平均相對(duì)繁殖速率作為待檢基因抗蚜性鑒定的依據(jù)，

平均相對(duì)生長(zhǎng)速率（g/d）=[LN(最終蚜蟲(chóng)總重量)-LN(起始蚜蟲(chóng)總重量)]/接蚜天數(shù)×100%

平均相對(duì)繁殖速率（No./d）=(最終蚜蟲(chóng)數(shù)量-起始蚜蟲(chóng)數(shù)量)/接蚜天數(shù)。

10.如權(quán)利要求1所述的鑒定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述大豆為感蚜蟲(chóng)大豆品種Williams82。