[發(fā)明專利]用于以RT-LAMP法檢測H7N9禽流感病毒的引物、試劑盒、檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310293648.8
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103320544A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 王長軍;張錦海;李丙軍;胡丹;呂恒
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 何朝旭;周海斌

技術領域

本發(fā)明涉及一種用于以RT-LAMP法檢測H7N9禽流感病毒的引物、試劑盒、檢測方法及試劑盒檢驗方法，屬于生物技術領域。

背景技術

禽流感病毒屬正粘病毒科甲型流感病毒屬。禽甲型流感病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑80～120nm，有囊膜；其基因組為分節(jié)段單股負鏈RNA。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分為16個H亞型(H1～H16)和9個N亞型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染豬、馬、水貂和海洋哺乳動物。自1959年以來，H5、H7和H9等亞型病毒已逾10次跨越物種障礙感染人類。現(xiàn)在已經(jīng)確認能夠感染人的禽流感病毒共有8種，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7，以及2013年發(fā)現(xiàn)的H7N9。

自2013年2月起，中國爆發(fā)了人感染H7N9禽流感病毒的疫情，臨床表現(xiàn)為流感樣癥狀和重癥肺炎，病死率高，導致至少131人發(fā)病，其中39人死亡（截止2013年5月31日）。這種全球首次發(fā)現(xiàn)的新型禽源性重組甲型流感病毒，在短期內(nèi)造成了至少65億美元的經(jīng)濟損失，并已對人類健康構成嚴重威脅，而且不能排除該病毒進一步進化成有效人傳人，引發(fā)未來流感大流行的可能性。

加強對流感樣病例尤其是重癥肺炎，以及候鳥、家禽類的H7N9禽流感病毒的快速檢測，對全球的H7N9疫情監(jiān)測與防控意義重大。目前已有的免疫膠體金檢測方法，敏感性較低，難以檢出臨床病例（Baas?C,et?al.Euro?surveillance,2013）。基于H7N9禽流感病毒HA基因和NA基因的逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（rRT-PCR,世界衛(wèi)生組織、中國疾控中心推薦方法，參見http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/en/），具有敏感、特異的優(yōu)點，但需昂貴的設備、專業(yè)的技術、繁瑣的操作，不適合現(xiàn)場檢測或者條件較差的基層實驗室。因此，目前迫切需要建立一種新的簡單易行、快速敏感的H7N9禽流感病毒檢測方法。

據(jù)申請人所知，環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）及逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增（reverse?transcription?loop-mediated?isothermal?amplification,RT-LAMP）是一類新型核酸擴增方法，擴增反應全過程均在同一溫度下進行，不須像PCR反應那樣需要經(jīng)歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程，因此對擴增所需儀器的要求大大簡化，整個擴增過程只需一臺水浴鍋或恒溫金屬浴即可，反應時間一般只需15min至60min，并且不需要通過繁瑣的核酸電泳方法來檢測結果，只需通過其副產(chǎn)物-白色的焦磷酸鎂沉淀來觀察結果（可用濁度儀實時掃描判定），或者預先加入HNB或鈣黃綠素等金屬離子螯合劑，通過反應前后的溶液顏色變化，直接目視觀察以判斷結果，無需其它任何設備。

其中，RT-LAMP方法具有簡便、快速、敏感、高效的特點，非常適合在基層實驗室甚至現(xiàn)場進行快速診斷，目前亟需建立一種能夠靈敏、特異、高效檢測H7N9禽流感病毒的RT-LAMP檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的是：針對現(xiàn)有技術存在的問題，提供一種用于以RT-LAMP法檢測H7N9禽流感病毒的引物，可有效檢測H7N9禽流感病毒。

本發(fā)明的第二目的是：提供含有上述引物的試劑盒，可用于檢測H7N9禽流感病毒。

本發(fā)明的第三目的是：提供采用前述試劑盒的檢測方法，可直觀地根據(jù)反應液顏色判斷結果，快速準確。

本發(fā)明的第四目的是：提供針對前述試劑盒的檢驗方法，確保使用正常的試劑盒來得到可靠的結果。

實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的技術方案如下：一種用于以RT-LAMP法檢測H7N9禽流感病毒的引物，其特征是，包括H7引物組和N9引物組；其中，

H7引物組包括外引物對H7-F3和H7-B3，內(nèi)引物對H7-FIP和H7-BIP，以及環(huán)引物H7-LB；H7-F3的序列如SEQ?ID?NO:1所示，H7-B3的序列如SEQ?ID?NO:2所示，H7-FIP的序列如SEQ?ID?NO:3所示，H7-BIP的序列如SEQ?ID?NO:4所示，H7-LB的序列如SEQ?ID?NO:5所示；