[發(fā)明專利]高產(chǎn)乙醇脫氫酶醋酸桿菌的復(fù)合誘變育種方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310292859.X
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103352035A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王陶;李文;李同祥;董玉瑋
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12R1/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 唐惠芬

1.一種高產(chǎn)乙醇脫氫酶醋酸桿菌的復(fù)合誘變育種方法，其特征在于：醋酸桿菌經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化、基礎(chǔ)培養(yǎng)基液體搖床培養(yǎng)獲得菌懸液；將稀釋的菌懸液置于無菌培養(yǎng)皿中于30W紫外燈下輻射誘變1-3min；紫外誘變后的菌懸液涂布于含有0.01-0.02%的氯化鋰誘變培養(yǎng)基上；選出氯化鋰誘變培養(yǎng)基上透明圈直徑與單菌落直徑比值（H/C）較大的突變株，經(jīng)斜面培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集菌體，破碎細(xì)胞，采用分光光度法測定上清液中乙醇脫氫酶活力。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乙醇脫氫酶醋酸桿菌的復(fù)合誘變育種方法，其特征在于：具體育種方法按如下步驟進(jìn)行：

（1）將待誘變的醋酸桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上，置于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72?h，取斜面活化的醋酸桿菌2-3環(huán)接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于120?r/min、32℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24?h得菌懸液；

（2）紫外誘變處理前，開啟超凈工作臺紫外燈，預(yù)熱20min，使光波穩(wěn)定；取稀釋至10^-3-10^-4的菌懸液10mL置于滅好菌的直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置在磁力攪拌器的載物臺上，打開皿蓋，在紫外燈垂直下方20?cm處進(jìn)行紫外照射，照射時間為2-3min；

（3）取紫外誘變后的菌懸液0.1mL涂布于含有0.01-0.02%的氯化鋰誘變培養(yǎng)基上，用黑色塑料袋包裹，放入32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72?h；

（4）挑選長勢良好、透明圈直徑與單菌落直徑比值（H/C）較大的突變株于斜面培養(yǎng)基，于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72?h，接種2-3環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于120?r/min、32℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72h；

（5）取培養(yǎng)液離心，棄上清液得到菌體沉淀，用蒸餾水洗滌2～3次；每克濕菌體加入3mL?20mmoI/L的?Tris-HCl緩沖溶液、2mL?10%?的TritonX-100溶液，置室溫下反應(yīng)10min，離心，收集上清液，采用分光光度法測定乙醇脫氫酶的活力，篩選得到高產(chǎn)乙醇脫氫酶的菌株，Tris-HCl緩沖溶液的pH=8.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乙醇脫氫酶醋酸桿菌的復(fù)合誘變育種方法，其特征在于：所述的斜面培養(yǎng)基為：葡萄糖1g，酵母膏1g，瓊脂2g，CaCO₃?1g，無水乙醇3mL，水100mL，pH?4.5；所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，無水乙醇3?mL，水100mL，pH?4.5；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，無水乙醇4?mL，水100mL，pH?6.0；所述的氯化鋰誘變培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，瓊脂2g，CaCO_3?2g，氯化鋰0.01-0.02g，無水乙醇3?mL，水100mL，pH?4.5。