[發明專利]一種基于PCR技術的染色體步移方法

無效

• 申請號: 201310291978.3
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103361338A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 景志忠;劉太安;房永祥
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種染色體步移方法，更具體地說，涉及一種利用PCR技術和末端加尾技術來進行染色體步移擴增未知基因或調控元件序列的方法。

背景技術

染色體步移（chromosome?walking）是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關系的目的序列的方法和過程。該技術在解決尋找已知基因啟動子和調控原件、研究基因內含子和外顯子邊界、探知特定位點上游和下游序列以及分析外源基因在基因組中插入位點等問題上發揮著關鍵作用，是一項重要的分子生物學研究技術。但傳統的基于基因組文庫的染色體步移方法，需要構建龐大、完整的基因組文庫，耗時耗力，步驟繁瑣，而基于PCR技術的染色體步移方法由于其比較簡便快速，得到了廣泛的應用，是當前染色體步移方法的主流技術。

由于PCR技術需要依靠上下游兩條引物來引導擴增其中間的序列，所以根據在未知序列一端設計引物的策略，目前該技術可分為三類：連接介導的步移方法；隨機或簡并引物介導的步移方法和加尾介導的步移方法。這些方法都各有優缺點，連接介導法受限于酶切位點分布的隨機性或連接效率不高等；隨機或簡并引物對于一些復雜的模板結合力有限，而且通常需要很低的退火溫度，特異性不高；加尾介導方法雖然效率很高但不依賴模板，所以目前使用的都是同聚寡核苷酸引物，如oligo?dT、oligo?dG，然而oligo?dT引物一般都需要較低的退火溫度，oligo?dG引物的退火溫度雖然可以做到和一般的特異性性引物相差不大(Leoni?C,?Gallerani?R,?Ceci?L?R,?A?genome?walking?strategy?for?the?identification?of?eukaryotic?nucleotide?sequences?adjacent?to?known?regions.?2008,?44:?229-235.)，但其很容易結合到DNA模板中的GC富含區，所以此類引物的特異性也不是很強。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術和方法的缺陷，提供一種特異、高效的染色體步移擴增未知基因或調控元件序列方法。

本發明的一種基于PCR技術的染色體步移方法是：以目標DNA序列為模板，在已知序列處設計并合成兩條向未知序列端延伸的巢式特異性引物P1和P2，根據P2設計確定互補的P3引物，首先以P1引物引導DNA單鏈的合成，利用末端加尾酶在合成的單鏈DNA?3’端先加上多于15個的任意第一堿基，再在第一堿基后加上多于15個非互補的第二堿基；將前述的加尾后的DNA單鏈為模板，以P2和P3為引物進行擴增。

本發明的基于PCR技術的染色體步移方法中P3引物中寡聚堿基在10～16個之間。

本發明的基于PCR技術的染色體步移方中P3引物中寡聚堿基在在8～12之間。

為達到該目的，本發明所采取的技術方案和步驟如下：依據PCR技術的原理和特性，以目標DNA序列為模板，在已知序列處設計并合成兩條向未知序列端延伸的巢式特異性引物P1和P2（見圖1），首先以P1引物引導DNA單鏈的合成（見圖2），利用末端加尾酶在合成的單鏈DNA?3’端先加上多于15個堿基的polyT，后再加上多于15個堿基的polyG（見圖3），然而，本發明并不局限于以上這種加尾方式，根據四種堿基互補的特性，凡是先加polyA或polyT，后加polyG或polyC均可以達到相同效果；根據上步加尾的序列設計與其反向互補的P3引物，P3引物中寡聚G或C最好在10～15個堿基之間，寡聚A或T最好在8～12之間，以P2和P3(如5’-CCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAA-3’)為上下游引物，以上述加尾后的DNA單鏈為模板，進行PCR擴增（見圖4），將擴增后的產物經TA克隆后進行測序。

本發明與現有技術相比，具有明顯的特點和優勢：該方法很好的保持了末端加尾法介導的染色體步移方法的優點，如省去了繁瑣的酶切和連接步驟，避免了使用隨機或兼并引物時易出現的非特性擴增和引物結合力有限等問題。使用5’寡聚C（11C）和3’寡聚A（11A）引物可以結合到模板polyT和polyG末端的中間區域，既具有正常的引物退火溫度，又避免了引物3’端非特異性結合到模板的GC富含區，所以該方法所獲得的步移產物，其特異性更強、步移距離也較長。通過對該方法的兩次實施結果表明其適合于擴增外源基因在哺乳動物細胞基因組中的插入位點，這說明該方法在鑒定轉基因動物中外源基因插入位點方面有十分廣闊的應用前景。

附圖說明