[發明專利]一種用于溶菌酶檢測的雙輸出傳感器及其制備方法

有效

• 申請號: 201310291776.9
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103344576A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 林振宇;邱素艷;郭隆華;邱彬;陳國南
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: G01N21/25
• 分類號: G01N21/25;G01N21/78;G01N21/64;G01N21/33
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種用于溶菌酶檢測的雙輸出傳感器及其制備方法。

背景技術

溶菌酶全稱為14-O-溶菌酶，又稱N-乙酰基胞酸水解酶，等電點pI為11左右，是一種堿性水解酶，存在于微生物和多種動植物的組織及體液中。它可以裂解細菌細胞N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的-14-苷鍵，因而具有抗菌、抗腫瘤、抑制血管生成等活性，在生物體內具有重要作用。乳房炎是奶牛三大疾病之一，對奶牛業的影響很大，天然奶牛乳汁中的溶菌酶含量較低，可能是導致乳房炎高發病率的主要原因。同時，溶菌酶與各種腫瘤疾病也息息相關。有研究者報道稱胃癌、大腸癌分泌的溶菌酶致使黏液癌細胞侵襲力強，是癌細胞轉移率高的原因之一。

目前有很多基于溶菌酶與其適配體DNA的結合而提出的方法應用于溶菌酶的檢測，例如熒光法、電化學法、電致化學發光法、酶聯免疫法、表面等離子體共振法和毛細管電泳法。由于溶菌酶通常要耗費長時間與其適配體DNA結合，致使這些方法都需要大量的時間，并且操作也較為復雜，成本高，大大限制了其在現場檢測和日常生活中的應用。而本發明則是通過金納米顆粒顏色的變化以及三唑化合物的熒光強度的變化構建一種雙輸出傳感器，對溶菌酶進行檢測。該傳感器成本低、靈敏度高、制備簡單，可實現現場檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于溶菌酶檢測的雙輸出傳感器及其制備方法，本發明對溶菌酶的檢測靈敏度高、特異性好；既可以通過比色檢測，也能借助于熒光光譜和紫外光譜檢測。從50?ng/mL到5.0?ug/mL濃度范圍內對溶菌酶檢測呈現良好地線性響應。其肉眼能觀察到的最低濃度為50?ng/mL，熒光和紫外光譜的檢測限為23?ng/mL。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于溶菌酶檢測的雙輸出傳感器的制備方法包括以下步驟：

（1）按照參考文獻（Sivakumar,?K.;?Xie,?F.;?Cash,?B.?M.;?Long,?S.;?Barnhill,?H.?N.;?Wang,?Q.?A?Fluorogenic?1,3-Dipolar?Cycloaddition?Reaction?of?3-Azidocoumarins?and?Acetylenes.?Org.?Lett.,?2004,?6,?4603-4606.）制備3-疊氮-7羥基香豆素；

（2）將1.0?mM丙炔胺與1.0?mM?3-疊氮-7羥基香豆素混合后，再加入0.1?mM?CuSO₄與0.5?mM抗壞血酸鈉，室溫培育10分鐘，發生點擊化學反應，生成三唑香豆素化合物；

（3）按照參考文獻（Liu,?D.;?Chen,?W.;?Wei,?J.;?Li,?X.;?Wang,?Z.;?Jiang,?X.?A?Highly?Sensitive,?Dual-Readout?Assay?Based?on?Gold?Nanoparticles?for?Organophosphorus?and?Carbamate?Pesticides.?Anal.?Chem.?2012,?84,?4185-4191.）制備直徑為13?nm的金納米粒子溶液；

（4）將10?uM三唑香豆素化合物和100?uL金納米粒子溶液在pH為7.5的10?mM?MOPS（3-（N-嗎啉基）丙磺酸）緩沖溶液中混合2分鐘，再加入0.25?mM聚乙烯吡咯烷酮，溶液呈現酒紅色。

由于溶菌酶與金納米顆粒表面結合能力大于三唑香豆素化合物的結合能力，致使溶菌酶加入至三唑香豆素化合物功能化的金納米顆粒溶液中，溶菌酶取代了三唑香豆素化合物在金納米顆粒表面的位置，使部分的三唑香豆素化合物回到溶液中，與金納米顆粒表面的距離增大，不能發生熒光共振能量轉移（FRET），導致先前被金納米顆粒淬滅的三唑香豆素化合物的熒光得到恢復，并且觀測到溶液顏色由酒紅色變為藍紫色。

本發明的顯著優點在于：

（1）本發明的三唑香豆素化合物合成方法簡單、快速、反應條件溫和、容易控制，得到的三唑香豆素化合物具有優良的光學性能和光穩定性。

（2）本發明的金納米顆粒表面功能化方法簡單、快速，得到的功能化的金納米顆粒溶液穩定。

（3）本發明的雙輸出傳感器在識別溶菌酶的過程中，除了溶液顏色發生變化外，紫外吸收光譜和熒光光譜也發生了明顯的變化，其特征明顯，有利于對溶菌酶的檢測。

（4）紫外吸收光譜和熒光光譜具有操作簡單、便捷、靈敏、成本低等優勢。

附圖說明