[發明專利]一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復合物用于基因轉染的方法

有效

• 申請號: 201310291576.3
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103435815A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 史向陽;孔令丹
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C08G83/00
• 分類號: C08G83/00;A61K48/00;A61K47/34;A61P35/00;C12N15/63
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復合物用于基因轉染的方法，包括：

（1）分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液、N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液中，攪拌反應2-4h，得到活化的mPEG-COOH；然后將活化的mPEG-COOH加入到第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應12-30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH₂-mPEG₂₀；其中EDC和NHS與mPEG-COOH的摩爾比為1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1；

（2）將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH₂-mPEG₂₀加入到氯金酸HAuCl₄·4H₂O溶液中，攪拌反應20-30min，再加入硼氫化鈉NaBH₄溶液，攪拌2-4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-mPEG₂₀}DENPs；其中HAuCl₄·4H₂O與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH₄與HAuCl₄·4H₂O的摩爾比為5:1；

（3）將端基分別為氨基和羧基的聚乙二醇NH₂-PEG-COOH溶液加入到6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯6-MAL溶液中，攪拌反應6-8h，得到MAL-PEG-COOH溶液；然后加入巰基端環狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽RGD-SH溶液，攪拌反應10-12h，得到RGD-PEG-COOH溶液；然后再分別加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD-PEG-COOH；然后將活化的RGD-PEG-COOH加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應12-30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀；然后按步驟（1）中的過程，得到活化的mPEG-COOH，加入到G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀中，反應12-30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀；其中NH₂-PEG-COOH、6-MAL、RGD-SH的摩爾比為1:1:1，EDC和NHS與RGD-PEG-COOH的摩爾比為1.8:1，EDC和NHS與mPEG-COOH的摩爾比為1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1；

（4）將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀中加入HAuCl₄·4H₂O溶液攪拌15-30min，再加入NaBH₄溶液，攪拌2-4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}DENPs；其中HAuCl₄·4H₂O與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH₄與HAuCl₄·4H₂O的摩爾比為5:1；

（5）將步驟（1）（2）（3）（4）所得的溶液進行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的G5.NH₂-mPEG₂₀，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-mPEG₂₀}DENPs，G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}DENPs；分別將G5.NH₂，G5.NH₂-mPEG₂₀，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-mPEG₂₀}DENPs，G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}DENPs給它們命名為K0，K1，K2，K3，K4；

（6）按照相應的N/P比，取K1，K2，K3，K4用無菌水稀釋，并用無菌水稀釋質粒，然后混合均勻，37℃孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復合物/pDNA；其中N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團摩爾比，數值范圍為1:1-5；

（7）將U87MG細胞種于24孔板上，于37℃、5%CO₂培養24h，更換成無血清的培養基，加入步驟（6）所得的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復合物/pDNA，混合均勻，在培養箱中孵育4h，然后將培養基換成有血清的培養基繼續培養24h，檢測基因轉染效率。