[發(fā)明專(zhuān)利]鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310291104.8
• 申請(qǐng)日: 2013-07-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103320539A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;曾婷婷;謝麗基;劉加波;鄧顯文;龐耀珊;謝志勤;范晴;羅思思
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專(zhuān)利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于PCR試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR試劑盒。

背景技術(shù)

鴨坦布蘇病毒（Duck?Tanbusu?Virus，DTBSV）是引起產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降、死亡和小鴨神經(jīng)癥狀、死亡的一種病毒性傳染病的病原。該病主要侵害處于產(chǎn)蛋期的成鴨，可以使處于產(chǎn)蛋高峰期的母鴨的產(chǎn)蛋率在幾天之內(nèi)降到20%以?xún)?nèi)甚至為0，也可以引起雛鴨的神經(jīng)癥狀和死亡，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。新城疫（Newcastle?disease?Virus，NDV）是引起雞等走禽和飛禽呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重病變的病毒，之前一直被認(rèn)為對(duì)鴨等水禽的致病性不強(qiáng)，但今年來(lái)陸續(xù)有鴨等水禽感染新城疫病毒后發(fā)病的報(bào)道，說(shuō)明病毒已經(jīng)逐漸適應(yīng)了水禽的機(jī)體，對(duì)水禽產(chǎn)生了致病性。產(chǎn)蛋鴨感染新城疫強(qiáng)毒之后，同樣會(huì)引起產(chǎn)蛋下降，且剖檢也會(huì)見(jiàn)到卵巢出血充血等病變。目前，鴨坦布蘇病毒的檢測(cè)方法包括間接ELISA和PCR，新城疫病毒的檢測(cè)方法有HI、PCR等。

PCR技術(shù)由于具有敏感性高、特異性好、快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已經(jīng)走進(jìn)臨床診斷實(shí)驗(yàn)室并廣泛應(yīng)用于各種禽病病原體的檢測(cè)，包括用于DTBSV和NDV的檢測(cè)。二重RT-PCR是一種特殊的PCR形式，其突出特點(diǎn)是，一次RT-PCR反應(yīng)，能同時(shí)檢測(cè)并鑒別出兩種病原體，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種敏感性好、特異性高、快速方便、低成本、高效率的鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR試劑盒，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)和鑒別鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒兩種病原體。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重PCR引物組，包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1∶1∶1∶1。

上述鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR引物組在二重RT-PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，二重RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為50℃-60℃。

二重RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為54℃。

鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR試劑盒，該試劑盒含有以下試劑：A液：引物組和One-Step?RT-PCR試劑盒；引物組包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，引物組中各引物的濃度為25μM，各1μL，One?Step?RT-PCR試劑盒包括2×one-step?reaction?mix（含4種dNTP、RT反應(yīng)緩沖液組成和PCR反應(yīng)緩沖液組成）、TransScript?one-step?emzyme?mix（含反轉(zhuǎn)錄酶和PCR?Taq酶）和去離子水；B液：鴨坦布蘇病毒cDNA和新城疫病毒cDNA，作為陽(yáng)性對(duì)照；C液：去離子水，作為陰性對(duì)照。

上述鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重PCR試劑盒在二重RT-PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，二重RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為50℃-60℃。

二重RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為54℃。

針對(duì)目前缺乏對(duì)鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，據(jù)此建立了鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR檢測(cè)方法，并制備了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用本發(fā)明僅需一次RT-PCR反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)和鑒別鴨坦布蘇病毒和新城疫病毒兩種病原體，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)；而且本發(fā)明在引物設(shè)計(jì)上利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同可直接判定擴(kuò)增結(jié)果，更簡(jiǎn)便、直觀(guān)和實(shí)用。本發(fā)明的待測(cè)樣品可來(lái)自健康動(dòng)物或死亡動(dòng)物，可為DNA和/或RNA，最低能同時(shí)檢出10pg鴨坦布蘇病毒RNA、10pg新城疫病毒RNA，這為兩種病毒的發(fā)病早期提供了準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，對(duì)切斷其傳播途徑有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)鴨養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

附圖說(shuō)明

圖1是二重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中：M為分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp?DNA?ladder；1為10ng?DTBSV和10ng?NDV；2為1ng?DTBSV和1ng?NDV；3為100pg?DTBSV和100pg?NDV；4為10pg?DTBSV和10pg?NDV；5為1pg?DTBSV和1pg?NDV；6為100fg?DTBSV和100fg?NDV；7為10fg?DTBSV和10fg?NDV；8為1fg?DTBSV和1fg?NDV；9為陰性對(duì)照（水）。