[發(fā)明專利]一種用VEGF165基因修飾的毛囊干細胞作為種子細胞的人工皮膚的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310290592.0
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103468745A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 全仁夫;黃忠名;鄭宣;許世超
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61L27/38;A61L27/60
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.一種用VEGF165基因修飾的毛囊干細胞作為種子細胞的人工皮膚制備的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）選用一周齡SD大鼠觸須部皮膚，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態(tài)完好且處于生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗后放入50mL培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12補充培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2d換液一次；所述的DMEM/F12補充培養(yǎng)基成分為：44mlDMEM/F12培養(yǎng)液、5mlKSR血清替代物、500μl青鏈霉素混合液、500μl?L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50μl羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松；

2)毛囊干細胞的純化：將100μg/ml的IV型膠原按照3ml/100mm?dish的量包被在培養(yǎng)皿中，室溫靜置1h；將100mm培養(yǎng)皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，20min后，將未貼壁的細胞連同培養(yǎng)液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換液；P2代再純化一次；

3）毛囊干細胞的鑒定：

a、采用Q-PCR法：分選純化后的P3代毛囊干細胞進行Q-PCR檢測，用△△Ct法進行各基因表達的相對定量；

b、細胞免疫熒光染色法：將P3代細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，消化后接種在玻片上，貼壁培養(yǎng)2d后，吸掉培養(yǎng)液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室溫封閉；分別加入一抗整合素β1抗鼠多克隆抗體、整合素a6多克隆抗體以及角蛋白15多克隆抗體，室溫孵育，PBST洗滌后，再加標記二抗避光30min，加DAPI染核5min，避光晾干，用mounting?solution封片，觀察；

4）包裝慢病毒：取對數(shù)生長期的293T細胞，提前24h接種于100mm培養(yǎng)皿中，待次日細胞長至50%-70%即可；病毒包裝采用鈣轉(zhuǎn)法進行：轉(zhuǎn)染前將293T細胞培養(yǎng)基更換為不含雙抗的培養(yǎng)基，包括10％FBS+DMEM高糖；接著，目的質(zhì)粒pLenti-IRES-VEGF165-EGFP10ug和3種包裝質(zhì)粒VSVG、RSV-REV、RRE各5ug加入50ulHBS液中輕輕混勻，然后補充ddH2O至500μl作為B液，另準備500μlCaCl2A液，接著將B液加入A液中，打出氣泡，室溫放置2min；逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，十字水平搖晃多次；待孵育培養(yǎng)10-12h，更換為培養(yǎng)液為含10％FBS+DMEM高糖+1%雙抗；48h后細胞出現(xiàn)融合并有強綠色熒光表達時，收集培養(yǎng)上清，用0.45μm孔徑濾膜過濾后，用超速離心機4℃，55000rpm/min離心3h，除去上清后，然后加100μl培養(yǎng)基吹打分裝成2管，-80℃保存病毒液；

5）慢病毒感染毛囊干細胞：取培養(yǎng)的毛囊干細胞，提前1天按照1×10⁵/孔的濃度將生長狀態(tài)良好的P3代的毛囊干細胞消化、離心后用50μl病毒原液和50μl補充培養(yǎng)基混勻的吹打后接種在預(yù)舖膠的24孔板，在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱靜置30min，再補加400μl補充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后換液，48h、72h后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，獲得VEGF165基因修飾毛囊干細胞；

6）明膠海綿三維組織支架制備：

A.取含量為5%的明膠溶解于25℃的蒸餾水10ml，分別加入0.05%6-硫酸軟骨素鈉鹽和0.2%透明質(zhì)酸鈉鹽；

B.室溫下用磁力攪拌器攪拌60分鐘后，將交聯(lián)劑0.5%1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽溶液和0.25%N-羥基琥珀酰亞胺溶液滴入溶液中混勻5分鐘后，再將溶液注入12控辦孔板的模具中，水平搖晃均勻；

C.于-80℃下冷凍2小時；

D.然后上凍干機，凍干24小時得到厚度為2mm的多孔海綿狀的Gel-C6S-HA支架；

7）取之前4℃保存的明膠海綿支架，用75%乙醇消毒，再用PBS徹底沖洗；平鋪于50mm培養(yǎng)皿中，置于37℃CO₂培養(yǎng)箱中孵育1h；先將感染72h后的毛囊干細胞用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化后，取細胞懸液，500r/min離心5min，棄上清，用1mlDMEM/F12液重新懸浮細胞并計數(shù)，用注射法以1×10⁷/cm²的密度將細胞接種于明膠海綿支架內(nèi)部和表面，DMEM/F12補充培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%的CO₂孵箱內(nèi)37℃液面下培養(yǎng)2周，細胞融合后改為氣-液界面培養(yǎng)10d。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的人工皮膚。