[發(fā)明專利]VEGF165基因修飾的毛囊干細胞及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310290239.2
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103468744A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設計）人: 全仁夫;黃忠名;鄭宣;許世超
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發(fā)明涉及皮膚組織工程學領域，尤其涉及一種毛囊干細胞基因修飾的方法和該方法獲得的毛囊干細胞。?

技術領域?

皮膚作為人體最大的器官，具有感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌與排泄、防止水分蒸發(fā)等多種作用，其中最主要的功能是作為人體與外界環(huán)境的屏障以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時其也是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，特別是作為“世界工廠”的我國制造業(yè)和手工業(yè)的繁榮發(fā)展，各種涉及皮膚缺損的外傷特別是燒傷、壓軋傷、切割傷等也越來越多。其中，外傷導致的皮膚大面積缺損常常導致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前臨床上治療皮膚缺損的標準治療方法是自體皮膚移植，由于具有無免疫排斥反應，成活率高等特點，其在臨床上應用極為廣泛，并取得了很好的療效。但自體皮膚移植的缺點也非常明顯，由于是自體取材，其本身就是對患者的再次損傷，極大增加了患者痛苦，而且有發(fā)生供皮區(qū)感染，不愈合等并發(fā)癥的風險。更為嚴重的是，對于上述的大面積皮膚缺損，常由于缺乏足夠可供移植的自體皮膚而導致創(chuàng)面修復困難，嚴重影響了治療進程，甚至導致死亡。?

正因如此，科學家們一直試圖尋找一種外源性的皮膚替代物。早在公元前1500年，異種皮膚移植就被用于臨時覆蓋皮膚缺損創(chuàng)面。而隨著組織工程學的創(chuàng)立和發(fā)展，皮膚組織工程學迅速興起，并成為近十年來研究的熱點。組織工程學是應用工程學及生命科學的原理與方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高組織功能的一門學科。目前，國外應用皮膚組織工程學構(gòu)建人工皮膚的研究已取得了實質(zhì)性進展，Apligraf、OrCel、Suprathel、Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等產(chǎn)品已先后被美國藥品與食品管理局(FDA)批準上市并已應用于臨床皮膚缺損的治療中。?

然而，雖然目前已有以上數(shù)種人工皮膚產(chǎn)品可供臨床選擇，也確實促進了對大面積皮膚缺損患者的臨床治療。但是，根據(jù)我們多年臨床應用過程中遇到的問題，結(jié)合文獻報道，我們認為目前人工皮膚移植還存在著許多問題，其中甚至包括可能導致治療最終失敗的“硬傷”：①由于以上人工皮膚產(chǎn)品都沒有血管生成能力，導致移植的人工皮膚沒有血管系統(tǒng)供給營養(yǎng)，從而使人工皮膚容易發(fā)生壞死，使移植失敗。②人工皮膚產(chǎn)品中所含的各種異體細胞容易引起免疫排斥反應，臨床上常出現(xiàn)移植的皮膚壞死、脫落，嚴重的甚至出現(xiàn)全身免疫反應等嚴重并發(fā)癥，并且有可能傳播疾病。③目前所有的人工皮膚產(chǎn)品都只能恢復正常皮膚的部分解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，而無法再生具有重要功能的皮膚附屬器結(jié)構(gòu)，例如：血管、毛發(fā)、汗腺等。?

毛囊干細胞是一類存在于毛囊外根鞘隆突部的干細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點。體外培養(yǎng)研究中的毛囊干細胞表現(xiàn)出了高克隆形成能力，具有很高的再生潛能。由于毛囊干細胞來源于毛發(fā)，可以直接從患者自身取得，數(shù)量極其豐富，且沒有任何并發(fā)癥，對患者完全無創(chuàng)，現(xiàn)已成為皮膚組織工程學研究的焦點。Taylor等（Taylor?G,Lehrer?MS,Jensen?PJ,et?al.Involvement?of?follicular?stem?cells?in?forming?not?only?the?follicle?but?also?the?epidermis.Cell,2000,102(4):451-461.）研究發(fā)現(xiàn)毛囊干細胞不僅能夠分化形成毛囊，而且還參與了表皮組織的形成過程。Stelios等發(fā)表的最新研究結(jié)果證明，頭發(fā)毛囊中含有大量的干細胞，是最容易獲得的干細胞來源之一，并已成功將毛囊干細胞分化發(fā)育生成新的脈管系統(tǒng)。血管內(nèi)皮細胞生長因子165(VEGF165)是血管內(nèi)皮細胞生長因子5種亞型之一，其活性最強，分布范圍最廣，是VEGF體內(nèi)發(fā)揮作用的主要亞型。近年來圍繞VEGF165為中心的血管再生性基因治療研究成為國內(nèi)外研究熱點。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決目前人工皮膚產(chǎn)品存在的可能影響臨床應用效果的諸多問題，本發(fā)明的一個目的是提供VEGF165基因修飾毛囊干細胞的方法，本發(fā)明的另外一個目的是提供上述的方法獲得的VEGF165基因修飾毛囊干細胞。本發(fā)明以毛囊干細胞為種子細胞，具有體外培養(yǎng)時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應；同時利用VEGF165基因轉(zhuǎn)染修飾毛囊干細胞，能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統(tǒng)，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。?

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：?

VEGF165基因修飾毛囊干細胞的方法，該方法包括以下的步驟：?