[發(fā)明專利]一種利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310290034.4
• 申請(qǐng)日: 2013-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103513039A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 松陽(yáng)洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州美格生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，包括定向肽庫(kù)的設(shè)計(jì)、定向肽庫(kù)的合成構(gòu)建、目標(biāo)蛋白的體外表達(dá)純化、定向肽庫(kù)與目標(biāo)蛋白的反應(yīng)、定向肽庫(kù)的肽段洗脫分離、定向肽庫(kù)的肽段線性化、線性化肽段的鑒定測(cè)序步驟，其特征在于：所述定向肽庫(kù)由線性肽或環(huán)狀肽組成，所述線性肽是由(Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m所示的氨基酸組成的多肽，所述環(huán)狀肽是由環(huán)-((Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m-R-R′)所示的氨基酸組成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非簡(jiǎn)并的天然或非天然的a-氨基酸，R-R′是環(huán)狀肽的連接處，n和m代表0～10個(gè)氨基酸數(shù)目。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：采用BOP/HOBt化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)法合成可溶性的線性肽或可溶性的環(huán)狀肽或在固定支持相上直接合成線性肽或環(huán)狀肽，采用Na-FMOC封閉法保護(hù)線性肽或環(huán)狀肽的氨基酸，環(huán)狀肽在R-R′處連接成環(huán)，在環(huán)狀肽庫(kù)的簡(jiǎn)并位置，加入等量的不同種的已用Na-FMOC封閉的氨基酸于反應(yīng)體系中。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述固定支持相為纖維素膜。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述線性肽或環(huán)狀肽的肽段長(zhǎng)度為5～25個(gè)氨基酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：目標(biāo)蛋白的體外表達(dá)純化的步驟為：用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)GST-目標(biāo)融合蛋白，昆蟲(chóng)細(xì)胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM?Tris?pH8.0，150mM?NaCl，10%甘油，2mM?EDTA，1mM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，1mM二巰基蘇糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，隨后用谷胱甘肽親和柱純化目標(biāo)蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫(kù)與目標(biāo)蛋白的反應(yīng)體系為：將純化的目標(biāo)蛋白加入300μL含有1mg線性肽或環(huán)狀肽混合物的溶液中，所需各種因子的濃度為100mM?ATP，包含約6×10⁵cpm的[γ-^32P]ATP，1mM?DTT，10mM?MgCl₂和50mM?pH7.0的Tris，室溫孵育10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫(kù)的肽段洗脫分離的步驟是：肽段混合物以pH5.5-6.0的高鹽溶液上金屬離子柱，然后柱子用pH6.0的低鹽溶液洗去非磷酸化肽段的非特異結(jié)合以及多余的鹽離子，最后，以pH8.0的洗脫溶液洗脫結(jié)合的磷酸化肽段。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫(kù)的肽段線性化是由溴化氫打斷肽鍵或由蛋白酶切割。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用定向肽庫(kù)檢測(cè)蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述線性化肽段的鑒定采用Edman降解法或質(zhì)譜法自動(dòng)化測(cè)序。