[發明專利]一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法

有效

• 申請號: 201310290034.4
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103513039A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 松陽洲
• 申請（專利權）人: 廣州美格生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，包括定向肽庫的設計、定向肽庫的合成構建、目標蛋白的體外表達純化、定向肽庫與目標蛋白的反應、定向肽庫的肽段洗脫分離、定向肽庫的肽段線性化、線性化肽段的鑒定測序步驟，其特征在于：所述定向肽庫由線性肽或環狀肽組成，所述線性肽是由(Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m所示的氨基酸組成的多肽，所述環狀肽是由環-((Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m-R-R′)所示的氨基酸組成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非簡并的天然或非天然的a-氨基酸，R-R′是環狀肽的連接處，n和m代表0～10個氨基酸數目。

2.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：采用BOP/HOBt化學反應偶聯法合成可溶性的線性肽或可溶性的環狀肽或在固定支持相上直接合成線性肽或環狀肽，采用Na-FMOC封閉法保護線性肽或環狀肽的氨基酸，環狀肽在R-R′處連接成環，在環狀肽庫的簡并位置，加入等量的不同種的已用Na-FMOC封閉的氨基酸于反應體系中。

3.根據權利要求2所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述固定支持相為纖維素膜。

4.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述線性肽或環狀肽的肽段長度為5～25個氨基酸。

5.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：目標蛋白的體外表達純化的步驟為：用昆蟲細胞表達GST-目標融合蛋白，昆蟲細胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM?Tris?pH8.0，150mM?NaCl，10%甘油，2mM?EDTA，1mM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，1mM二巰基蘇糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，隨后用谷胱甘肽親和柱純化目標蛋白。

6.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫與目標蛋白的反應體系為：將純化的目標蛋白加入300μL含有1mg線性肽或環狀肽混合物的溶液中，所需各種因子的濃度為100mM?ATP，包含約6×10⁵cpm的[γ-^32P]ATP，1mM?DTT，10mM?MgCl₂和50mM?pH7.0的Tris，室溫孵育10min。

7.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫的肽段洗脫分離的步驟是：肽段混合物以pH5.5-6.0的高鹽溶液上金屬離子柱，然后柱子用pH6.0的低鹽溶液洗去非磷酸化肽段的非特異結合以及多余的鹽離子，最后，以pH8.0的洗脫溶液洗脫結合的磷酸化肽段。

8.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽庫的肽段線性化是由溴化氫打斷肽鍵或由蛋白酶切割。

9.根據權利要求1所述的利用定向肽庫檢測蛋白質與其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述線性化肽段的鑒定采用Edman降解法或質譜法自動化測序。