[發明專利]特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5及其應用

在審

• 申請號: 201310289021.5
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103320445A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 徐發良;陳小樂
• 申請（專利權）人: 重慶市腫瘤研究所
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;C12N5/095;A61K47/26;A61P35/00
• 代理公司: 重慶大學專利中心 50201
• 代理人: 王翔

技術領域

????本發明涉及基因工程領域,具體是一種特異性識別胃癌細胞的DNA寡核苷酸適配子GCA-5的序列和修飾，以及修飾后的GCA-5在識別胃癌細胞方面的應用，包括用于臨床胃癌組織標本的輔助診斷、胃癌分子靶向診斷、胃癌生物導向治療，基礎研究中胃癌細胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標志物的識別和鑒定。

背景技術

已證實，胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。盡管早期胃癌的治療效果較好，但診斷率低；由于胃癌早期的臨床表現缺乏特異性，多數胃癌患者確診時已屬進展期，手術及放化療效果都不理想。可見，胃癌的預后主要依賴于分期，其診斷和治療的重點是早期。目前，早期胃癌診治的主要手段（金標準）仍然是內鏡活檢和內鏡粘膜下切除術（Yada?T,et?al.Diagn?Ther?Endosc?2013;2013:241320）。然而，這需要特殊的儀器設備、較高的費用和施術者的經驗積累，患者的耐受性和依從性也難以保證，因而仍然面臨普及難和不易實現早發現、早診斷的問題。因此，更可靠、更方便、更廉價和更容易普及的胃癌診治手段亟待發現和制備應用。

近年來，眾多的高通量生物技術方法不斷涌現，其中細胞-SELEX技術可篩選特異性結合于細胞的核酸適配子，這為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的可能。SELEX是指數富集的配基系統進化技術（systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment）的英文縮寫，利用該技術通過多次反復的擴增和篩選循環，可以從隨機單鏈DNA或RNA庫中獲取特異性結合于靶物質的核酸序列，稱為適體（aptamer）或適配子；適配子具有精確識別、高特異性、高親和力結合靶標等特性，且容易在體外合成和修飾、理化性質穩定、費用低廉、獲取周期短等優勢。隨著SELEX技術本身的不斷發展以及靶標范圍的不斷拓展，近年出現了以活細胞為靶標進行的SELEX篩選，即細胞-SELEX（cell-SELEX或cell-based?SELEX）技術（徐發良,等.第二軍醫大學學報2012;33:432-435）。通過細胞-SELEX篩選而獲得的適配子，可用于腫瘤細胞的富集與檢測、腫瘤診斷、靶向治療和腫瘤標志物研究（Fang?X,?et?al.?Acc?Chem?Res?2010;43:48-57）。我們利用細胞-SELEX的篩選原理和實驗方法（Sefah?K,?et?al.?Nat?Protoc?2010;5:1169-1185），以胃癌細胞株為陽性篩選細胞、以正常胃粘膜細胞為對照細胞，建立了篩選腫瘤細胞DNA適配子的方法；該技術的一個顯著優勢在于，研究者無須事先明確腫瘤細胞特定的靶分子，就可以篩選出特異性結合于腫瘤細胞的適配子。借助蛋白質組學的技術，可對適配子結合的靶標進行分離、鑒定，進而成為潛在的腫瘤標志物。

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發明內容

本發明的目的是提出特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5,?以及修飾后的GCA-5在識別胃癌細胞方面的應用，包括用于臨床胃癌組織標本的輔助診斷、胃癌靶向診斷、基礎研究中胃癌細胞的分離、純化、鑒定和胃癌的生物導向治療。

本發明是結合了國內外的研究進展以及發明人自身的工作積累，以胃癌細胞株為靶標、以正常胃粘膜為消減靶標，通過成功建立細胞-SELEX技術篩選到一個適配子GCA-5（gastric?cancer?aptamer）。經鑒定，GCA-5能特異性識別并結合胃癌細胞株，而不與正常胃粘膜細胞及結腸癌細胞株結合；尤其重要的是，GCA-5也能特異性識別并結合來自臨床胃癌手術標本的癌細胞；而對照核酸序列與上述細胞均無結合。這對于胃癌的臨床輔助診斷、分子靶向診斷和生物導向治療中所需試劑盒和藥物的制備具有重要意義。由于經過FITC或TAMRA標記的GCA-5可以直接用于熒光方法檢測腫瘤細胞，其操作比傳統的免疫學方法更簡單。另外，GCA-5可能通過特定的靶標分子結合于胃癌細胞，從而在胃癌細胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標志物的鑒定方面得到應用。因此，本發明可以在臨床醫學和基礎醫學中得到廣泛應用。

為實現本發明目的而采用的技術方案是這樣的，一種特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5的核苷酸序列為:SEQ??ID??NO.1。

進一步可以再在所述核苷酸序列SEQ?ID?NO.1的5’端標記熒光素（如FITC、TAMRA等）或酶類物質(生物素和地高辛)等，并通過熒光檢測設備、鏈親和素標記的辣根過氧化物酶檢測系統和抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶檢測系統，對胃癌細胞進行示蹤、定位和檢測。

上述核苷酸在制備靶向定位胃癌細胞的試劑盒中的應用。