[發明專利]一種非病毒基因載體材料及其制備方法和應用、腦靶向基因傳輸系統及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310288893.X
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103435814A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 鵬越峰;張璇;蔡青青;房麗晶;余再丹;尚鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院;深圳市精神衛生中心
• 主分類號: C08G81/00
• 分類號: C08G81/00;C12N15/87;A61K48/00;A61P25/28
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種非病毒基因載體材料及其制備方法和應用、腦靶向基因傳輸系統及其制備方法和應用。?

背景技術

RNA干擾（RNA?interference，RNAi）是一種強有效的基因沉默工具，已被廣泛應用于基因功能、細胞信號轉導通路、藥物靶點的篩選、基因治療等研究領域。?

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s?disease，AD，Alzheimer病）是一種中樞神經系統原發性退行性變性疾病，主要臨床相為癡呆綜合癥，致殘致死率極高。隨著基因治療技術的發展，對AD采用RNA干擾手段以抑制腦內代謝異常并減少β淀粉樣蛋白（Aβ）的生成是一個嶄新的思路。但如何將針對靶點的小干擾RNA（small?interfering?RNA，siRNA）安全有效地穿過血腦屏障（blood-braid?barrier,BBB）及如何使治療基因在腦內保持長期的高表達而達到治療目的，是目前RNA干擾技術中面臨的一個難點，也是基因治療能否在臨床應用的關鍵所在。?

陽離子聚合物是近年來發展起來的一類非病毒基因載體，主要有聚賴氨酸（PLL）、聚乙烯亞胺（PEI）、殼聚糖（chitosan）、魚精蛋白（protamine）和樹狀聚合物（dendrimer）等。聚丙烯亞胺（Poly(propylenimine)，PPI)樹狀聚合物1993年首次被合成出來，該聚合物以二胺為引發劑，以丙烯腈為結構單元，通過反復的Michael加成和腈的還原得到不同代數的樹狀大分子，PPI樹狀大分子的大小由代數來標明，并隨代數增加而增加。PPI含有100%可質子化的氮，生理pH條?件下能夠被質子化帶上正電荷，通過與siRNA或DNA鏈上負電性的聚電解質（磷酸根）的靜電作用締合成復合物，內部的氨基使其具有較強的緩沖能力。這些樹狀聚合物形態是均一的，它們在介導基因轉染方面具有明顯優勢。?

與DNA的結合能力是PPI發揮轉染作用的先決條件，研究發現，隨著代數的增加，PPI與DNA的結合能力增強，第一代PPI并不能有效的結合DNA，第二代PPI在N/P比較高的情況下可結合部分DNA，第三代以上的PPI可有效地結合DNA。Hollins?AJ等（Pharm?Res,2004,21(3):458-466）研究表明，較低代數的PPI如第二代、第三代表面分別含有8到16個氨基，可介導反義寡脫氧核苷酸轉染A431表皮樣細胞。一般來講PPI的毒性會隨著代數的增加而急劇增加，這大概是目前為止PPI沒有像PAMAM一樣被廣泛研究的原因之一。?

開發或構建低毒、安全實用同時具有較高轉染率、靶向、可生物降解且生物相容性好的新型基因載體材料及靶向基因傳輸系統是RNAi技術成功應用的途徑之一，僅有一些相關內容供參考，例如，Koppu等(J.Control?Release,2010,143(2):215-221)將第三代PPI連接上轉鐵蛋白（Tf），使其可通過腫瘤細胞上存在的Tf受體介導的內吞作用進入到腫瘤細胞中，研究表明具有明顯的腫瘤靶向性，且未表現出明顯的毒性。?

發明內容

為解決上述問題，本發明第一方面旨在提供一種非病毒基因載體材料的制備方法，該非病毒基因載體材料低毒、轉染率高、可生物降解且生物相容性好。本發明第二方面旨在提供該非病毒基因載體材料。本發明第三方面旨在提供該非病毒基因載體材料在制備治療中樞神經系統原發性退行性變性疾病治療工具中的應用。本發明第四方面旨在提供由該非病毒基因載體材料偶聯乳鐵蛋白組成的腦靶向基因傳輸系統的制備方法。本發明第五方面旨在提供由該非病毒基因載體材料偶聯乳鐵蛋白組成的腦靶向基因傳輸系統。本發明第六方面旨在提供腦靶向基因傳輸系統在制備治療中樞神經系統原發性退行性變性疾病治療工具中的應用。?

第一方面，本發明提供了一種非病毒基因載體材料的制備方法，包括以下步?驟：?

（1）將第一聚丙烯亞胺、L-谷氨酸芐酯N-羧基環內酸酐在第一有機溶劑中混合，在0～40℃溫度下攪拌反應48～96h，蒸除部分第一有機溶劑，加入溫度為0～20℃的無水乙醚，攪拌后靜置，將靜置得到的沉淀抽濾，用無水乙醚洗滌，真空干燥，制得分枝狀的聚谷氨酸芐酯；?

所述第一聚丙烯亞胺如式A～式F中任一結構式所示，第一有機溶劑為鹵代烷有機溶劑或環醚類有機溶劑，所述第一聚丙烯亞胺與L-谷氨酸芐酯N-羧基環內酸酐的摩爾比為1:8～300；?