[發(fā)明專利]一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310288857.3
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103497950A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒曉鵬;鄭思春;馮啟理;鄒海望;徐智斌
• 申請（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

小分子RNA（miRNA）是一類長度約21～24核苷酸非編碼的小分子RNA，廣泛存在于動、植物體中。一系列實驗表明miRNA可能是一類在進(jìn)化上保守的、在生物體中具有重要調(diào)控作用的分子。

miRNA源自細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成pri-microRNA，接著被Drosha酶剪切為長度約70?bp呈發(fā)夾狀的pre-miRNA，隨后被核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，之后被Dicer酶剪切成長為18-26bp的miRNA雙螺旋復(fù)合體。其中一條解螺旋，并結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默的復(fù)合物內(nèi)，形成非對稱的RISC復(fù)合物。這個復(fù)合物通過其中的miRNA與靶mRNA的3’?UTR互補配對結(jié)合，從而降解靶目標(biāo)mRNA或阻斷其翻譯，實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的負(fù)調(diào)控。近年來盡管有大量的miRNA被鑒定，但僅少數(shù)miRNA的功能被闡明。有文獻(xiàn)報道，miRNA在基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物發(fā)育、抵抗脅迫、預(yù)防疾病等方面起著至關(guān)重要的作用。因此，研究對昆蟲抗藥性相關(guān)基因具有沉默功能的miRNA，并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的綜合治理成為近年研究的熱點。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種多功能的二相解毒酶，它廣泛存在于動物與植物中，它通過催化還原谷胱甘肽與親電性有毒物質(zhì)的結(jié)合作用而轉(zhuǎn)化為親水性的無毒物質(zhì)；?同時谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶還具有過氧化物酶活性，通過催化還原谷胱甘肽與脂質(zhì)過氧化中間或終端產(chǎn)物作用，而參與細(xì)胞內(nèi)因農(nóng)藥和重金屬等引起的氧脅迫，而增加生物體的耐性。但是，生物體中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一大家族基因，不同的同工酶可能有不同的作用底物與酶活性，而且雖然動物與植物體內(nèi)都有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，但對不同種類有毒物質(zhì)的降解作用會不一樣。

斜紋夜蛾為雜食性昆蟲，可危害多達(dá)290多種植物，特別是十字花科的經(jīng)濟(jì)作物，對經(jīng)濟(jì)收入有很大的影響。目前害蟲的防治仍以化學(xué)殺蟲劑為主，但大量而長期的使用不僅造成了各地害蟲的抗藥性，使殺蟲劑的劑量使用越來越多，進(jìn)而造成環(huán)境的污染和影響食品的安全。申請人從農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾中篩選出高活性的編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的解毒基因，以其為靶標(biāo)，研制出防治害蟲的抑制劑，為斜紋夜蛾的防治提供新思路。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種小分子RNA。

本發(fā)明的再一個目的在于提供該小分子RNA在害蟲防治中的應(yīng)用。

申請人從斜紋夜蛾中獲得了一小分子RNA，命名為Sli-miR-2771，其序列為：UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG（SED?ID?NO.1）。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測Sli-miR-2771可能調(diào)控slgste1，并通過熒光素酶報告載體實驗、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗、蟲體注射實驗以及實時熒光定量PCR等多種實驗技術(shù)，證實了Sli-miR-2771可通過結(jié)合slgste1的3’非編碼區(qū)，抑制slgste1的表達(dá)。蟲體體內(nèi)實驗更證實了Sli-miR-2771可以通過抑制slgste1的表達(dá)，使斜紋夜蛾減少了對有毒的植物次生物質(zhì)的解毒能力，進(jìn)而影響斜紋夜蛾進(jìn)食植物與生長狀況，達(dá)到害蟲防治的目的。該發(fā)明方法為害蟲防治提供了新思路和新途徑，在害蟲防治領(lǐng)域中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為注射miRNAs后斜紋夜蛾的體重統(tǒng)計結(jié)果；

圖2為注射miRNAs72h后斜紋夜蛾的外型觀察結(jié)果；

圖3為注射miRNAs后進(jìn)食芥菜的斜紋夜蛾中slgste1的表達(dá)量檢測結(jié)果；

圖4為熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNAs與slgste13’UTR結(jié)合的實驗流程圖；

圖5為miRNAs與slgste13’UTR結(jié)合實驗的熒光素酶活性測定結(jié)果；

圖6為細(xì)胞株添加miRNAs后吲哚-3-甲醇(I3C)對slgste1的誘導(dǎo)結(jié)果；

圖7為miR-2771與slgste1?3’?UTR結(jié)合的計算機(jī)模擬圖。

具體實施方式