[發明專利]基于克隆DNA混合池的全基因組測序方法

有效

• 申請號: 201310288791.8
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103388025A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 羅美中;潘永龍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

技術領域

本發明涉及全基因組測序技術領域，具體地指一種基于克隆DNA混合池的全基因組測序方法。

背景技術

全基因組序列作為一種研究物種全部遺傳信息的重要資源受到越來越多的關注。從2001年人類基因組草圖的完成，到2003年基因組全序列的正式完成以來，越來越多的物種完成了全基因組測序。對于植物基因組，擬南芥(Arabidopsis?thaliana)作為一種重要的模式植物，是第一個完成全基因組測序的高等植物。水稻作為重要的糧食作物，其全基因組序列也已完成。其中，水稻秈稻品種(Oryza?sativa?ssp.?indica)和粳稻品種(Oryza?sativa?ssp.?japonica)的全基因組序列均完成于2005年。另外，重要的飼料作物玉米的全基因組序列于2009年完成。

目前，全基因組測序的策略主要有兩種：clone-by-clone(CBC)和全基因組鳥槍法。

CBC的策略是首先構建遺傳圖譜(Genetic?map)和物理圖譜(Physical?map)，再根據物理圖譜選擇最小重疊路徑(Minimal?tiling?path,?MTP)上的克隆(BAC或YAC克隆)進行測序。對克隆序列組裝后，再將克隆序列一步一步地回歸定位到物理圖譜、遺傳圖譜和染色體上。在整個全基因組序列構建過程中，構建物理圖譜是非常耗時費力的一步。基于文庫的構建物理圖的常用方法大致可以分為兩類，基于標記的方法和限制性酶切圖譜的方法。基于標記的方法一般是將克隆混合成多維的混合池(Pool)，然后用特定的探針與混合池進行雜交或用設計好的引物對混合池進行PCR掃描，從而確定每個混合池含有的標記，再通過計算篩選得到每個克隆可能含有的標記。利用限制性酶切圖譜的方法，一般是用一種或多種限制性酶將每個克隆進行完全消化，然后對消化后的DNA片段進行電泳分離，從而得到每個克隆消化后DNA片段的長度信息，再根據這些片段長度信息利用計算機軟件把相互重疊的克隆連接起來，形成重疊群(Contig)。與基于標記的方法相比，限制性酶切圖譜的方法具有更高的分辨率和準確性，是現在用來構建物理圖譜應用較多方法。特別是利用熒光標記分辨DNA片段，并利用基因分析儀進行高通量自動化分析方法的開發，使得限制性酶切圖譜的方法得到更廣泛的應用。

物理圖譜對于定位基因，確定染色體，構建框架和全基因組的序列組裝是一種非常重要的工具，也是一種非常有用的基因組資源。同時，對于研究基因的功能和物種進化有著很大的價值。利用CBC策略完成全基因組測序的代表物種主要有人類，擬南芥，水稻的粳稻品種，玉米等。這些基因組的全序列的質量非常高，常作為很多研究中的參考序列。基于CBC策略進行全基因組測序，因為其高分辨率和高準確性，使其已經成為一種全基因組測序的“黃金法則”。但是，它也有不可避免的缺點：構建物理圖譜需要耗費大量的人力物力和時間，是整個測序過程中最為復雜的一步。因此，這種全基因組測序策略的應用也受到一定限制。

另一種全基因組測序的策略是全基因組鳥槍法測序(Whole?genome?shotgun?sequencing,?WGS)。這種方法不需要構建物理圖譜，直接將要測序物種的全基因組隨機打斷成一定長度范圍的小片段，將這些小片斷插入到載體中，再對這些小片段文庫直接進行測序，如人類的全基因組測序時，除了CBC方法外，也用了全基因組鳥槍法；水稻的秈稻品種93-11的全基因組序列便是用這種方法完成的。然后，將得到的序列根據序列的重疊信息進行拼裝，得到序列重疊群。再將這些拼裝后的序列定位到染色體上。在對小片段文庫進行測序時，又有兩種策略，一種是進行單向測序即只測得插入片段一端的序列；另一種是進行雙末端測序(Paired-end?sequencing)，其兩端的序列方向相反。相比于單向測序，雙末端測序不僅能夠利用序列之間的重疊信息來組裝序列重疊群，也可以利用插入片段的長度信息來將序列重疊群連接成更長的Scaffold。盡管雙末端測序能夠將序列重疊群相連接，但是由于重復序列或大的缺口的存在，還有很多的序列無法連接起來。針對這個問題，常常會構建多個不同插入片段大小的測序文庫如人類基因組測序時就構建了2-kb，10-kb和50-kb的測序文庫，這樣能夠有效地提高序列拼裝的連續性。由于全基因組鳥槍法測序有著簡單快速并不需要構建物理圖譜的優點，特別隨著下一代測序技術(Next-generation?sequencing?technologies,?NGS)的不斷發展，這種方法的運用越來越廣泛。