[發(fā)明專利]一株厭氧利用合成培養(yǎng)基高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌的篩選及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310288669.0
• 申請(qǐng)日: 2013-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN103320367A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜岷;劉嶸明;梁麗亞;包海姣;馬江鋒;陳可泉;韋萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.?一株利用合成培養(yǎng)基合成丁二酸的大腸桿菌，其分類命名為大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）BA405，其保藏號(hào)登記號(hào)為：CCTCC?NO：M?2013160。

2.?權(quán)利要求1所述的大腸桿菌菌株的篩選方法，其特征在于：大腸桿菌出發(fā)菌株經(jīng)等離子體誘變后，利用合成培養(yǎng)基純厭氧條件篩得快速生長的菌株，再經(jīng)血清瓶厭氧發(fā)酵篩得高產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌目標(biāo)菌株（Escherichia?coli）BA405。

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于：所述的大腸桿菌出發(fā)菌為BA305，保藏編號(hào)CCTCC?NO：M2012102。

4.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于：具體的篩選步驟如下：

1）?等離子誘變：將大腸桿菌出發(fā)菌株在試管中活化，37℃，200?r/min，過夜培養(yǎng)；得到的菌液用無菌生理鹽水稀釋至OD₆₀₀=1.0，滴加在無菌載片上；以氦氣為放電氣體，以80?~120?W為射頻功率，以10?~30?SLM作為氣體流量，以10~30?s為輻照時(shí)間，對(duì)菌株進(jìn)行等離子體誘變；

2）?合成培養(yǎng)基平板初篩：將誘變后的載片置于裝有1?ml的生理鹽水的具塞試管中，劇烈震蕩，將載片上的菌液洗脫，稀釋成不同的濃度涂布于合成培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24?h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；

3）?合成培養(yǎng)基平板復(fù)篩：將步驟2）中篩選到的菌株在合成培養(yǎng)基上反復(fù)轉(zhuǎn)點(diǎn)培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)24?h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；

4）?厭氧搖瓶發(fā)酵篩選：將步驟3）中篩選出的菌株接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃，200?r/min，培養(yǎng)6?h，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為2%（v/v），37℃，200?r/min，培養(yǎng)48?h；考察步驟3）中篩選出的菌落中篩選出生長速度快，產(chǎn)酸量高的菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于所述的步驟1）中等離子誘變條件為：100?W作為射頻功率，10?SLM作為氣體流量，15?s作為輻照時(shí)間。

6.權(quán)利要求1所述的大腸桿菌菌株在發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用。

7.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的具體應(yīng)用步驟如下：

（1）平板培養(yǎng)：將大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）BA405接種在平板培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24?h；

（2）種子培養(yǎng)：將平板培養(yǎng)的大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）BA405接種到種子培養(yǎng)基中，500?ml三角瓶裝液量100?ml，培養(yǎng)溫度為37℃，200?r/min，培養(yǎng)時(shí)間為6?h；

（3）發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸：將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，100?ml厭氧搖瓶裝液量為30?ml，堿式碳酸鎂作為pH調(diào)節(jié)劑，充二氧化碳2?min；培養(yǎng)溫度為37℃，200?r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48?-96h。