[發明專利]人源性尖吻蝮蛇蛇毒免疫ScFv抗體庫及其構建方法

無效

• 申請號: 201310286004.6
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103361742A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 劉明華;張雷;曹宇亮
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/10;C07K16/18
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 周維鋒

技術領域

本發明涉及抗體工程醫學，特別涉及噬菌體抗體展示技術，特別涉及人源性尖吻蝮蛇蛇毒噬菌體抗體展示技術。

背景技術

毒蛇咬傷是臨床常見臨床急癥之一。其具有發病急、變化快、并發癥多、致殘致死率高等特點，治療起來很困難，尤其是對并發多臟器功能衰竭的患者，治療更為棘手。尖吻蝮毒蛇（五步蛇）是我國最常見的三種毒蛇之一，尖吻蝮毒蛇咬傷后，最急性的反應是組織炎癥水腫、壞死、出血不凝等等，其中凝血異常是其最主要的特征性毒性反應，并易繼發全身多器官功能衰竭。其病理基礎是尖吻蝮毒蛇擁有大量的血液毒，如金屬蛋白酶、磷脂酶、C型凝集素樣蛋白、絲氨酸蛋白酶等等。尖吻蝮蛇毒具有特別豐富的生物學功能，主要為水解血管基底膜蛋白，產生持續性致死性出血，在受傷后機體組織損害效應方面起著至關重要的作用。尖吻蝮毒蛇咬傷后的治療一直是一個較為棘手的問題。

抗蛇毒血清是專供治療毒蛇咬傷的特異性藥物。目前,我國已生產了抗尖吻蝮蛇毒血清等數種單價抗蛇毒血清，世界上也已有單價、雙價、多價及抗蛇毒組份的抗蛇毒血清制品100多種。然而，雖經數十年制備工藝的發展，抗蛇毒血清質量有較大提高，但主要仍是通過應用全蛇毒對馬或綿羊進行超免獲得。由于蛇毒是一種復雜的蛋白混合物，含有超過lOO種以上的多樣性毒蛋白，其毒性和免疫原性各異，目前的全蛇毒免疫方法存在以下問題：(1)效價會因非毒素成分產生的抗體而降低，這樣治療效果下降，必須要增加抗血清的用量；(2)抗蛇毒血清為動物源性的抗體，含有大量非特異的蛇毒抗體及許多異種蛋白，有相當比例的患者因對動物蛋白過敏而發生速發型超敏反應；(3)外源性蛋白還能啟動抗異種蛋白反應，引起免疫復合物介導的遲發性變態反應，導致腎小球腎炎，甚至腎功能衰竭，如血清病。（4）因尖吻蝮蛇毒毒性很強，動物免疫時每次只能耐受小劑量的蛇毒，在此狀態下，蛇毒的一些毒性成分可能只有亞免疫源性的量，免疫操作就必須采用逐漸增加免疫劑量的方式，時間可能長達數月之久。免疫前毒素還須進行減毒和增加免疫源性等處理，并使用佛氏佐劑。所得血漿或血清經胃蛋白酶消化后，用硫酸銨鹽析法進行精制。即便如此，只有少數免疫動物能達到滿意的中和性抗體效價。（5）動物源性的抗蛇毒血清，其生產和保存成本較高。（6）在使用抗蛇毒血清前,必須進行免疫學的蛇種診斷。而蛇毒之間尤其是同屬的蛇種之間存在交叉反應，現有的免疫學診斷方法均采用純化后的多價抗體進行檢測，會造成在檢測中出現假象，存在很多缺陷。以上困難嚴重限制了抗蛇毒血清的生產和供應，并影響其使用的有效性和實用性。

近年，國外有學者嘗試采用人－人雜交瘤技術制備人源抗多種毒素的單克隆抗體（McAb），但至今未見相關產品問世。其原因多為產生McAb的人－人雜交瘤細胞難以培養、不能穩定分泌McAb，難以進入規模化生產。隨著基因工程技術的發展，采用轉基因小鼠制備全人化McAb成為可能，但此類抗體難以在小鼠體內大規模生產，且用于人體仍然存在鼠源蛋白和病毒污染的危險，此外，人源抗體在轉基因小鼠體內不能正確糖基化，必將影響抗體的生物功能，因此不是最理想途徑。

噬菌體抗體庫呈現技術的出現，為大規模、高通量篩選人源基因工程單克隆抗體提供了一個理想的技術平臺，利用該技術可建立人源抗尖吻蝮蛇毒抗體庫，可同時高通量篩選100％人源抗尖吻蝮蛇毒的基因工程抗體。抗體基因轉入CHO細胞后，可實現真核表達并在體外大規模生產，無病毒污染、用于人體不會引起過敏反應。目前，還未有相關的研究報道。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種人源性尖吻蝮蛇蛇毒抗體的篩選方法及篩選所得的噬菌體抗體文庫，該方法效率高，適用于工業生產；該方法篩選的抗體滴度高，應答持續時間長。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

人源性尖吻蝮蛇蛇毒免疫ScFv抗體庫的構建方法，具體包括以下步驟：

A人特異性IgG輕鏈PCR擴增

選用人特異性IgG輕鏈λ型的特異性引物進行PCR擴增，得λ型的PCR產物，選用人特異性IgG輕鏈κ型的特異性引物進行PCR擴增，得κ型的PCR產物；

B人特異性IgG的γ類重鏈PCR擴增

選用人特異性IgG的γ類重鏈的特異性引物進行PCR擴增，得重鏈PCR產物；

C輕鏈基因庫的構建

將步驟A所得的各個λ型的PCR產物和各個κ型的PCR產物與噬菌體酶切后連接入轉化體細菌，得輕鏈基因庫；

D人源性尖吻蝮蛇毒毒素免疫噬菌體ScFv抗體庫的構建