[發明專利]大麥原生質體制備及PEG介導轉化方法

有效

• 申請號: 201310285210.5
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103352023A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 邊紅武;韓凝;朱睦元;白玉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.用于PEG介導轉化的大麥原生質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（一）大麥幼苗的培養

大麥種子經自來水中浸泡2?h后，用10％次氯酸鈉表面消毒30?min，再用ddH₂O清洗8次；消毒后的種子平鋪在濕濾紙上，25℃下萌發；36?h后，種子露白，選取長勢良好的種子進行水培法培養：在pH?5.8的0.1mmol·L^-1?CaCl₂培養液中，以8小時光照/16小時黑暗的條件于25℃培養5天后，得到用于原生質體提取試驗的大麥幼苗；

（二）原生質體的制備

（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10?ml；

所述酶液的組份為：0.3?M的甘露醇、10?mM的MES、1.5%（wt/vol）的纖維素酶R10、0.75%（wt/vol）的離析酶R10、1mM的CaCl₂、0.1%（wt/vol）的BSA、1?mM的β-巰基乙醇，余量為ddH₂O；

（2）取50棵幼苗的莖段或5-7片葉子于滅菌的濾紙上，用新的刀片將其切成0.5-1?mm的薄片，切好后迅速加到有10?ml??0.3?M甘露醇的100?ml三角瓶中，以錫箔紙包好三角瓶，黑暗中放置10?min；

（3）用移液器棄甘露醇，盡量吸凈；加入10?ml酶液，錫箔紙包好三角瓶，放入真空罐中，抽真空條件200?psi以下，平板搖床上30轉/分鐘培養30?min；從真空罐中取出三角瓶，空氣中平板搖床上30轉/分鐘，培養3.5?h；

（4）加入等體積的W5試劑，平板搖床上40轉/分鐘，培養10?min；

所述W5試劑的組份為：154?mM?的NaCl、125?mM?的CaCl₂、5?mM?的KCl?、2?mM?的MES?，余量為ddH₂O?；

（5）用W5試劑潤濕100目的細胞篩，過濾步驟（4）中的培養產物，濾液用50?ml圓底離心管收集，再用20ml?W5試劑沖洗；

（6）500?rcf常溫離心3?min后，吸去上清；試管底部為綠色的一層原生質體；

（7）加入2?ml?W5試劑，輕柔搖晃離心管，使細胞懸浮；吸取細胞懸浮液至10ml圓底離心管中，錫箔紙包好使離心管避光，原生質體自然沉降30?min后，500?rcf離心3?min；移液器小心移去上清；留在圓底離心管底部的即為大麥原生質體。

2.利用權利要求1所述大麥原生質體的PEG介導轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在2?ml圓底離心管中加入5?ug的?pUGW11-GFP質粒，ddH₂O定容至10?ul混勻；再加入100?ul所述大麥原生質體，輕輕混勻后，加入110?ul?PEG–Ca²⁺試劑，輕輕混勻后，于25?℃室溫、黑暗放置20?min；

以大麥幼苗的莖為材料時，PEG–Ca²⁺試劑的組份為：0.3?M的甘露醇、0.1?M?的CaCl_2?、40%W/V的PEG?4000，余量為ddH₂O；

以大麥幼苗的葉片為材料時，PEG–Ca²⁺試劑的組份為：0.4?M的甘露醇、0.1?M?的CaCl_2?、40%W/V的PEG?4000，余量為ddH₂O；

（2）緩慢加入440?ul?W5試劑，緩慢顛倒試管，500?rcf離心3?min，小心移去上清；

（3）向試管中加入含50?ug/ml??Amp的WI試劑，如果使用12孔板，每管加入400?ul?WI試劑；如果使用24孔板，則每管加250?ul?WI試劑；輕輕混勻，然后轉移到多孔板上，室溫黑暗培養16h，得到原生質體的轉化產物；

所述WI試劑的組份為：0.5?M的甘露醇、20?mM的KCl、4?mM的MES、余量為ddH₂O?。