[發(fā)明專利]一種微囊化大腸桿菌口服滅活疫苗的優(yōu)化制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310285124.4
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103417963A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設計）人: 姚剛;徐新龍;蘇艷;黃嘉駟;雷成紅;馬雪蓮;蘇戰(zhàn)強
• 申請（專利權）人: 新疆農業(yè)大學
• 主分類號: A61K39/108
• 分類號: A61K39/108;A61K9/50;A61K47/36;A61K39/39;A61P31/04
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

本發(fā)明涉及微膠囊口服滅活疫苗的制備，通過正交試驗對壁材濃度、芯壁比、乳化劑含量、進出風溫度、均質速度和進樣速率進行優(yōu)化，并以包埋率、平均粒徑和免疫效果進行評估，保證產品的質量。?

背景技術

目前微膠囊技術應用十分廣泛，通過微囊化可以改善被包裹物質的物理性質（顏色、外觀、表觀密度、溶解性），使被包裹物質免受環(huán)境因素的影響，提高被包裹該物質的穩(wěn)定性，改善其反應活性、耐久性、熱敏性、光敏性和壓敏性等特性，減少有毒物質對環(huán)境造成的不利影響，屏蔽不良氣味，降低物質毒性，根據需要持續(xù)釋放物質進入外界環(huán)境等。微膠囊的制備技術起源于20世紀30年代，50年代末到60年代初人們開始把合成高分子的聚合方法用于微膠囊技術的研究，70年代微膠囊技術的工藝日臻成熟，應運領域不斷擴大，80年代后微膠囊技術的研究不僅發(fā)表了許多微膠囊合成技術的新專利，而且開發(fā)出納米膠囊。微膠囊技術憑借其具有提高疫苗穩(wěn)定性、生物相容性以及賦予疫苗靶向性及緩釋性等一系列優(yōu)越的性能，在獸用疫苗領域得到了越來越廣泛的應用。應用口服疫苗通過飲水或采食對動物進行預防接種，與傳統(tǒng)的注射給藥途經相比可減少因注射不當引起的感染，減輕注射對人和動物造成的不適感，具有安全易行、實用方便、省時省力等優(yōu)點，而且口服疫苗免疫后可刺激胃腸道粘膜產生sIgA抵御有害微生物和毒素對機體的損害，但直接口服滅活疫苗后由于消化道內的酸堿環(huán)境變化和各種酶的作用，疫苗極易喪失活性。?

本發(fā)明研制的微膠囊產品，將微膠囊化技術與口服給藥方式結合，更具有緩釋和靶向效果的口服疫苗，使其可以抵御胃酸和酶的破壞，到達指定部位吸收，從而提高吸收效率，達到理想的免疫效果。本工藝改變傳統(tǒng)大腸桿菌疫苗注射劑型，采用微囊包被技術制備新型口服制劑，使大腸桿菌疫苗的免疫接種途徑更加簡單方便，具體有重要的應用價值。?

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于：采用微囊包被技術制備的新型口服制劑，使大腸桿菌疫苗的免疫接種途徑更加簡單方便，提供反芻動物用大腸桿菌口服疫苗。?

本發(fā)明的目的是這樣實現的：一種微囊化大腸桿菌口服滅活疫苗的優(yōu)化制備方法，分步驟實施;?

步驟1芯材的制備：?

1)取凍干菌種，接種于滅菌的普通肉湯內，37℃培養(yǎng)20h，取此菌液，注射于實驗小白鼠的腹腔內，待其死亡后，無菌剖取肝臟進行勻漿，涂布于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用10%脫纖維蛋白的綿羊鮮血瓊脂平板繼續(xù)劃線分純至2代，經革蘭氏染色、鏡檢、純化后，挑取光滑圓整菌落，接種于鮮血瓊脂斜面，作為一級種子菌，此時再將其接種于普通肉湯內，37℃培養(yǎng)20h，純粹檢驗合格后，作為二級種子，4℃保存?zhèn)溆茫?

2）取二級種子菌液接種于營養(yǎng)瓊脂平皿，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，用含5‰甲醛的滅菌0.85%生理鹽水沖洗菌苔，收集菌液，先低速3000rpm離心去除培養(yǎng)基等雜質，再高速10000rpm，離心收集菌體，反復離心三次，用麥氏比濁法調整菌液濃度至200億菌/ml，置37℃溫箱滅活48h，期間振蕩數次，得滅活菌液，檢驗合格，進行配苗；?

3）取滅活好的滅活菌液與含蜂膠30mg/ml的乙醇提取液等體積混合，低速3000rpm攪拌均勻，制成褐色菌苗懸液，即得滅活抗原組織，4℃保存；?

步驟2微囊包被的主要影響因素試驗：?

設海藻酸鈉濃度、芯壁比、乳化劑含量、進風溫度、均質速度的不同梯度，以包埋率為主要評價指標，粒直徑大小為輔助指標，進行單因素試驗；?

1）在固定芯壁比為1:1、乳化劑含量為0.5%、進風溫度200℃、出風溫度80℃、進樣速率55ml/h、10000rpm均質15min的條件下，改變海藻酸鈉濃度為1%、2%、3%、4%、5%，測定其包埋率，獲得最佳壁材濃度，即海藻酸鈉濃度為1%-3%。?

2）在固定海藻酸鈉濃度為2%、乳化劑含量為0.5%、進風溫度200℃、出風溫度80℃、進樣速率55ml/h、10000rpm均質15min的條件下，改變芯壁比為1:1、1:2、1:3、1:5、1:8、1:10，測定其包埋率，獲得最佳芯壁比為：1:1-1:5。?

3）在固定海藻酸鈉濃度為2%、進風溫度200℃、出風溫度80℃、進樣速率55ml/h、10000rpm均質15min的條件下，改變乳化劑含量0.5%、1%、1.5%、2%、4%、6%，測定其包埋率，獲得最佳乳化劑含量乳化劑含量為：5-7%。?