[發(fā)明專(zhuān)利]一種對(duì)金銀花不定芽轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310284657.0
• 申請(qǐng)日: 2013-07-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103320469A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 向鳳寧;周冰謙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/84
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種對(duì)金銀花不定芽轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

金銀花(Lonicera?japonica?L.)是忍冬科忍冬屬的多年生半常綠纏繞木質(zhì)藤本植物，自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。具有抗菌抗病毒、解熱、升高白細(xì)胞、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等功能。金銀花的主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、揮發(fā)油等，其中綠原酸(Chlorogenic?acid)為主要功能性成分，其含量高低是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。金銀花的用途廣、用量巨大，伴隨其不斷的開(kāi)發(fā)新用途，用量不斷增加，是家喻戶(hù)曉的保健和去火飲品，目前金銀花的年需要量在萬(wàn)噸之上。但長(zhǎng)期以來(lái)，產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定、產(chǎn)值低成為限制生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵因素。在金銀花需求量猛增的新形勢(shì)下，通過(guò)植物遺傳技術(shù)來(lái)提高藥材產(chǎn)量，穩(wěn)定藥材質(zhì)量，增加種植收益具有重要的意義。?

農(nóng)桿菌是一類(lèi)革蘭氏陰性菌，包括根癌農(nóng)桿菌（含有致瘤Ti質(zhì)粒）和發(fā)根農(nóng)桿菌（含致根Ri質(zhì)粒），金銀花的遺傳轉(zhuǎn)化主要使用根癌農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒含有T-DNA區(qū)，T-DNA可將攜帶的任何基因整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入。?

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程包括：細(xì)菌在敏感細(xì)胞上吸附，植物傷口處產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)或外源添加酚類(lèi)物質(zhì)激活vir基因表達(dá)，vir基因表達(dá)產(chǎn)物作用于T-DNA使其產(chǎn)生T-DNA鏈，進(jìn)一步形成T-DNA復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞，此復(fù)合體在胞內(nèi)蛋白與細(xì)菌蛋白的共同作用下進(jìn)入細(xì)胞核，而后整合入植物基因組。?

經(jīng)檢索，目前尚無(wú)關(guān)于通過(guò)遺傳工程技術(shù)來(lái)提高金銀花種質(zhì)的報(bào)告及對(duì)金銀花不定芽轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種對(duì)金銀花不定芽轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。?

本發(fā)明所述對(duì)金銀花不定芽轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括金銀花無(wú)菌苗的獲得及培養(yǎng)、金銀花莖段的預(yù)培養(yǎng)、含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株的制備、農(nóng)桿菌菌液活化及農(nóng)桿菌侵染液制備、農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)、農(nóng)桿菌脫菌及誘導(dǎo)不定芽再生、金銀花小芽的分割及生根、抗生素陽(yáng)性苗的篩選、抗生素陽(yáng)性苗的移栽及DNA提取、轉(zhuǎn)基因植株的獲得等步驟；具體是：?

（1）金銀花無(wú)菌苗的獲得及培養(yǎng)?

將金銀花植株幼嫩枝芽剪下，用自來(lái)水沖洗30-40分鐘，剪去葉片將莖段、切成2厘米左右的小段，用70%乙醇消毒1-5分鐘，去凈乙醇后用0.1%HgCl₂消毒10-15分鐘，無(wú)菌水沖洗3-4遍。隨后用無(wú)菌濾紙吸去水分后將莖段放置于固體培養(yǎng)基上，在22℃-25℃下?光照培養(yǎng)。其中所述固體培養(yǎng)基配方為：MS+0.1-1.0mg/L?NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8；所述MS配方為：?

（2）金銀花莖段的預(yù)培養(yǎng)?

將培養(yǎng)20-30天的金銀花無(wú)菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2個(gè)節(jié)，將莖段沿側(cè)芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見(jiàn)的側(cè)芽；再將經(jīng)過(guò)上述處理的金銀花莖段切面向下置于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，22℃-25℃下暗培養(yǎng)3-4天，備用；其中，上述預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基配方為：MS+0.1-1.0mg/L?NAA+25-30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH5.8；?

（3）含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株的制備?

所選擇AGL104農(nóng)桿菌（載體購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司）為轉(zhuǎn)化菌株制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在50μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入含35S::C3’H過(guò)表達(dá)載體的質(zhì)粒3ul，之后冰浴30±5分鐘；放入液氮中1-5分鐘，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5-8分鐘；再加入800ulYEP，28±2℃、200-220rpm振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)；取出菌液涂布于含利福平及壯觀霉素的固體YEP?平板上，置28℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-3天，待菌落大小可見(jiàn)后取菌體進(jìn)行菌體PCR驗(yàn)證，對(duì)驗(yàn)證正確的菌體保存至4℃，備用；?