[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310284366.1
• 申請(qǐng)日: 2013-07-07
• 公開（公告）號(hào): CN103525744A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常明;余榛榛;劉睿杰;金青哲;王興國(guó);劉元法
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N9/16;C11B3/00;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 無(wú)錫互維知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，保藏編號(hào)為CCTCC?No.M2013301。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，CCTCC?No.M2013301，其特征在于：由下述方法制得：

（1）以保藏編號(hào)為CICC?No.21540的單核細(xì)胞增多性李斯特菌（L.monocytogenes）的基因組為模板，克隆得到磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示；

（2）將步驟（1）所得磷脂酶C基因克隆到表達(dá)載體pET-28a（+）上，得到重組載體；

（3）將步驟（2）所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到重組大腸桿菌。

3.用權(quán)利要求1或2所述重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-lm-plc，CCTCC?No.M2013301制備磷脂酶C的方法，其特征在于：以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備磷脂酶C。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：包括，

（1）種子培養(yǎng)：將所述重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，CCTCC?No.M2013301接種于種子培養(yǎng)基中，于28℃～37℃振蕩培養(yǎng)6h～14h，搖床轉(zhuǎn)速150～220r/min；

（2）液體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)過(guò)步驟（1）培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比1～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28～37℃振蕩培養(yǎng)4h～6h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150～220r/min；再添加乳糖，于18℃～32℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)10～25h，搖床轉(zhuǎn)速150～220r/min；最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)20～40h，發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；

（3）粗酶液的提取：將步驟（2）所得發(fā)酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細(xì)胞沉淀用Tris-HCl重懸后超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，收集上清，即為胞內(nèi)粗酶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟（1）所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨8～12g，酵母粉3～10g，NaCl8～12g，其余成分為水，pH7.2～7.6。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟（2）所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨8～12g，酵母粉5～25g，甘油0～6g，其余成分為0.25mol/L?Tris-HCl（pH7.2）。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟（2）所述乳糖的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基1～10g。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟（2）所述甘氨酸的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基0～5g。

9.一種植物毛油脫膠的方法，其特征在于：包括，

植物毛油的預(yù)熱和酸預(yù)處理；

加入如權(quán)利要求3所述的磷脂酶C進(jìn)行反應(yīng)；

滅酶，離心分離完成脫膠。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述植物毛油脫膠的方法，其特征在于：具體步驟如下：

（1）將植物毛油于具塞三角燒瓶中水浴加熱到60～80℃，加入質(zhì)量為總毛油質(zhì)量0.5%的質(zhì)量濃度為25%～50%檸檬酸溶液，在300～500r/min攪拌條件下進(jìn)行15～25min的酸預(yù)處理。

（2）將經(jīng)過(guò)酸預(yù)處理的油樣冷卻到40～60℃，加入一定量的4%NaOH溶液混合均勻來(lái)調(diào)節(jié)pH至4～7。

（3）再加入油重1%～3%的蒸餾水，和400～2000U/Kg的所述磷脂酶C，均勻混合，在40℃～75℃下300r/min～500r/min攪拌1～2h，進(jìn)行酶反應(yīng)。

（4）將反應(yīng)體系升溫至90℃以上進(jìn)行滅酶10min，在8000～10000r/min進(jìn)行10min離心分離，即完成所述磷脂酶C對(duì)植物毛油的催化脫膠。