[發(fā)明專(zhuān)利]突觸核蛋白內(nèi)含子1甲基化水平檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310283530.7
• 申請(qǐng)日: 2013-07-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103320518A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡延寧;于順;關(guān)恒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 長(zhǎng)春恒晨生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

1.一種突觸核蛋白內(nèi)含子1甲基化水平檢測(cè)方法，其特征在于：

a、亞硫酸氫鈉處理：用偏重亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚對(duì)基因組DNA進(jìn)行處理修飾，將未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變；基因組DNA使用0.3mol/L?NaOH變性；而后使用偏重亞硫酸氫鈉與對(duì)苯二酚混合溶液(pH?5.0)于50℃處理基因組DNA?16h；?用試劑盒純化DNA，并加入0.3?mol/L?NaOH于37℃孵育15min終止反應(yīng)，最后乙醇沉淀DNA；

b、PCR擴(kuò)增：按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及反應(yīng)條件如下：

正向擴(kuò)增引物：GAA,ATG,GAA,GTG,TAA,GGA,GGT,T?；

反向擴(kuò)增引物：Biotin-TTC,TAA,?TCC,ATC,CAA,CAT,CCA,C?；

擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性2min；?94°C變性20s，58°C退火20s，?72°C延伸20s，共50循環(huán)；最后72°C延伸5min；

c、單鏈制備：用鏈霉親和素偶連的瓊脂糖珠吸附生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，通過(guò)NaOH變性來(lái)制備單鏈DNA?；

d、焦磷酸測(cè)序樣本制備：經(jīng)變性的單鏈DNA和測(cè)序引物在80℃加熱結(jié)合成雜交體，冷卻成為焦磷酸測(cè)序樣本，

測(cè)序引物S1為：AGG,AGG,TTA,AGT,TAA,TAG,GT；??

測(cè)序引物S2為：GTT,AGG,GTG,GAG,GTT,GAG,AA；

e、焦磷酸測(cè)序分析前準(zhǔn)備：測(cè)序樣本加入酶的混合物和底物混合物進(jìn)行反應(yīng)；每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)---PPi；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)，并由軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，峰值高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比；根據(jù)加入dNTP類(lèi)型和熒光信號(hào)強(qiáng)度可實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列；其中酶的混合物是DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、雙磷酸酶混合，底物混合物是受質(zhì)APS和熒光素混合；

f、用計(jì)算機(jī)軟件分析計(jì)算出相應(yīng)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。