[發明專利]一種重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和脫膠工業中的應用

無效

• 申請號: 201310282627.6
• 申請日: 2013-07-07
• 公開（公告）號: CN103881955A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 常明;余榛榛;劉睿杰;金青哲;王興國;劉元法
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/16;C12N15/55;C11B3/00;C11B3/04;C12R1/19
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一株重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-C.p-PLC，保藏編號為CCTCC?No.M2013302。

2.根據權利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于：由下述方法制得：

（1）以保藏編號為CICC?No.22949的產氣莢膜梭菌的基因組為模板，克隆得到磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示；

（2）將步驟（1）所得磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a（+）上，得到重組載體；

（3）將步驟（2）所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。

3.用權利要求1或2所述重組大腸桿菌制備磷脂酶C的方法，其特征在于：以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備磷脂酶C。

4.根據權利要求3所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）種子培養：將所述重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-C.p-PLC，CCTCCNo.M2013302接種于種子培養基中，于28～37℃振蕩培養6～14h，搖床轉速150～220r/min；

（2）液體發酵培養：將經過步驟（1）培養所得活化種子液按體積百分比1～10％的接種量接種至發酵培養基，于28～37℃振蕩培養4～6h小時，搖床轉速150～220r/min；再添加乳糖，于18～32℃振蕩誘導培養10～25h，搖床轉速150～220r/min；最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續振蕩誘導培養20～40h，發酵完畢，得到發酵液；

（3）粗酶液的提取：將步驟（2）所得發酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀用Tris-HCl重懸后超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，收集上清，即為胞內粗酶液。

5.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（1）所述種子培養基成分按克/升計為：蛋白胨8～12g，酵母粉3～10g，NaCl8～12g，其余成分為水，pH7.2～7.6。

6.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述發酵培養基成分按克/升計為：蛋白胨8～12g，酵母粉5～25g，甘油0～6g，其余成分為0.25mol/L?Tris-HCl。

7.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述乳糖的添加量為每升所述發酵培養基1～12g。

8.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述甘氨酸的添加量為每升所述發酵培養基0～5g。

9.一種植物毛油脫膠的方法，其特征在于：包括，

植物毛油的預熱和酸預處理；

加入如權利要求3所述的磷脂酶C進行反應；

滅酶，離心分離完成脫膠。

10.根據權利要求10所述植物毛油脫膠的方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）將植物毛油于具塞三角燒瓶中水浴加熱到60～80℃，加入質量為總毛油質量0.5%的質量濃度為25%～50%檸檬酸溶液，在300～500r/min攪拌條件下進行15～25min的酸預處理；

（2）將經過酸預處理的油樣冷卻到40～60℃，加入一定量的4%NaOH溶液混合均勻來調節pH至4～7；

（3）再加入油重1%～3%的蒸餾水，和400～2000U/Kg的重組磷脂酶C，均勻混合，在40℃～75℃下300r/min～500r/min攪拌1～2h，進行酶反應；

（4）將反應體系升溫至90℃以上進行滅酶10min，在8000～10000r/min進行10min離心分離，即完成重組磷脂酶C對植物毛油的催化脫膠。