[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)枯草芽孢桿菌漆酶的基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310280822.5
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103320374A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 管政兵;廖祥儒;宋晨萌;張寧
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C02F3/34;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種高效表達(dá)枯草芽孢桿菌漆酶的基因工程菌，是將漆酶基因cotA導(dǎo)入E.coli?BL21(DE3)得到的基因工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述cotA的核苷酸序列如GeneBank中Sequence?ID：KC751428的序列所示。

3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，其步驟如下：

（1）設(shè)計引物p5和p6，利用PCR向漆酶基因cotA的DNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Kpn?Ι和Hind?ΙII限制性酶切位點；

（2）通過雙酶切、連接將漆酶基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pColdII，構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdII-X1；

（3）將pColdII-X1轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行測序驗證；

所述引物p5的序列為：5′-TCAGGAGGTACCATGACACTTGAAAAATTTGTG-3′，引物p6的序列為：5′-ACTGAGAAGCTTTTATTTATGGGGATCAGT-3′；所述限制性酶切位點以加下劃線的字母表示。

4.一種以權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)漆酶的方法，其步驟如下：

（1）將含重組質(zhì)粒pColdII-X1的大腸桿菌BL21(DE3)在37°C、250rpm條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5；

（2）隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速160rpm；

（3）誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎菌體，利用Ni⁺柱親和層析法純化得到可溶性漆酶，咪唑洗脫濃度為450mM。

5.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌在印染廢水脫色中的應(yīng)用。