[發明專利]測定微生物制劑降低煙葉中蛋白質含量的作用因子的方法

有效

• 申請號: 201310280585.2
• 申請日: 2013-07-05
• 公開（公告）號: CN103308627A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 趙敏;汪長國;戴亞;李寧;寇明鈺;吳艷;劉一兵;曾代龍;楊軍;雷金山;賈玉紅;胡希;楊振;廖占和
• 申請（專利權）人: 川渝中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;C12Q1/68
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽

1.一種測定微生物制劑降低煙葉中蛋白質含量的作用因子的方法，其特征在于，其測定步驟如下：

a）將分離篩選的微生物接種培養基，振蕩培養后取菌液離心，將上清液過濾，得到代謝產物；

b）對微生物的代謝產物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳或雙向電泳，再切取膠帶或挖點酶解；

c）對膠帶或膠點進行液相色譜串聯質譜法分析；

d）對性質相同的不同煙葉分別用微生物制劑上清液、微生物制劑菌體、微生物制劑菌液和水進行處理，

e）對上述經過處理的煙葉進行芯片雜交，測定與植物防御應答、激素代謝、細胞周期調控和酶調控有關的基因上調表達和基因下調表達。

2.根據權利要求1所述的測定微生物制劑降低煙葉中蛋白質含量的作用因子的方法，其特征在于，步驟e）的具體步驟如下：

I??芯片設計

利用煙草4×44K芯片，根據煙草cDNA序列設計，探針長度為60-mer；

II??提取四種不同處理煙葉的RNA

（1）取不同處理的煙葉樣品，取材后放入液氮中保存備用；

（2）取出各樣品分別放入用液氮預冷的研缽中，加入液氮后快速磨成粉末狀，轉移至1.5?mL無RNase的離心管中；

（3）每0.1?g組織樣品，加入1000?μL?Trizol，充分搖勻，室溫放置10?min；

（4）12000?rpm，4℃，離心10?min，取上清液至1.5?mL離心管；

（5）加氯仿200?μL，輕輕搖勻，靜置5?min；

（6）10000?rpm，4℃，離心10?min后，取上清液至1.5?mL離心管；

（7）加異丙醇800?μL，輕輕搖勻，靜置10?min；

（8）12000?rpm，4℃，離心10?min；棄上清液，加75﹪乙醇1000?μL，并將沉淀彈起來；

（9）10000?rpm，4℃，離心5?min；棄上清液，加75﹪乙醇1000?μL；

（10）10000?rpm，4℃，離心5?min；棄上清液，放置大約1?h使其干燥；

（11）用100?μL?DEPC處理過的水溶解RNA并電泳檢測；

III??RNA的檢測

首先電泳檢測RNA的完整性，然后用紫外分光光度計檢測純度和濃度，步驟如下：

（1）凝膠制備

稱取0.48?g瓊脂糖于25?mL?ddH₂O中，加熱溶解，冷卻至60℃，依次加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液8?mL和甲醛溶液7?mL，室溫下放置30?min，制成40?mL、濃度為1.2%的凝膠；

（2）電泳樣品制備

在0.5?mL離心管中加入以下溶液：總RNA?5?μL、甲酰胺10?μL、甲醛3.5?μL和5×甲醛凝膠電泳緩沖液2?μL；將混合液置于65℃溫浴15?min后，冰浴2?min；瞬時離心使管中溶液全部集中于管底，加入2?μL滅菌的經過DEPC處理的甲醛凝膠電泳上樣緩沖液，混勻；

（3）電泳

取2?μL樣品點樣，用1×甲醛凝膠電泳緩沖液電泳；

IV??RNA?純化?

RNA?純化是在RNA?電泳條帶沒有降解的條件下進行的，具體是使用?RNeasy?mini?spin?column?試劑盒對?RNA?進行純化；?

（1）純化柱的?RNA?最大結合量為?100?μg；在超凈工作臺中，吸取?100?μg?RNA，體積不足?100?μL，取?DEPC?處理的?H₂O?補足至?100?μL?混勻；

（2）吸取?3.5?μL?β-巰基乙醇加入到?350?μL?RLT?buffer?中混勻，然后將?β-巰基乙醇-RLT?buffer?加入到?100?μL?RNA?樣品中混勻，再加入?250?μL?100％乙醇，用加樣器上下混勻，不要渦旋和離心，作用?10-15?min；

（3）將?700?μL液體轉移到純化柱中，在柱中靜止?1-2?min，室溫，12000?rpm?離心?15?sec；

（4）棄去收集管中的液體，向柱中加入?500?μL?RPE?buffer，室溫，12000rpm?離心?15?sec；

（5）棄去收集管中的液體，室溫，12000?rpm?離心?1min；

（6）把純化柱放入另一個新的?1.5?mL?離心管中，加入?30?μL?60℃預熱的?DEPC?水到純化柱上，靜止?2-3?min，室溫，12000?rpm?離心1?min；

（7）再在純化柱上加入?30?μL?60℃預熱的?DEPC?水，靜止?2-3?min，室溫，12000?rpm?離心1min；

重復一次步驟7和步驟8；

V??探針熒光標記

取5μg總RNA反轉錄為cDNA并進行熒光標記（Cy5?and?Cy3-dCTP，GE?Healthcare?Cat.?No.?PA?55021/?PA?53021）；?1、2、3和4分別代表噴施微生物制劑的上清液、菌體、菌液和水；將1標記Cy5，4標記Cy3；2標記Cy5，4標記Cy3，進行熒光交換，比對結果取平均值；3標記Cy5，4標記Cy3；比對方式為1、2、3分別比對4；

VI??雜交與清洗

標記的?DNA?溶于?80?μL?雜交液中（3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart’s，25%甲酰胺），于42℃雜交過夜；雜交結束后，先在?42℃左右含?0.2%?SDS，2×SSC?的液體中洗?5?min，而后在?0.2×SSC?中室溫洗?5?min；玻片甩干后即可用于掃描；

20×SSC?的配制：在?800?mL?水中溶解?175.3?g?NaCl?和?88.2?g?檸檬酸鈉，加入數滴?HCl?溶液調節?pH?至7.0，加水定容至?1?L，分裝后高壓滅菌；

10％SDS?的配制：在?900?mL?水中溶解?100?g?電泳級?SDS，加熱至?68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節溶液的?pH?值至7.2，加水定容至?1?L，分裝備用；

VII??芯片掃描和數據分析

用?Feature??Extraction?軟件掃描芯片并提取探針信號值，再用?GeneSpring?軟件進行數據分析，并篩選差異基因；標記“detected”為表達基因；將噴施MP制劑上清、菌體和菌液的煙葉樣本的信號值分別比上噴施水的煙葉樣本。