[發(fā)明專利]用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的方法、分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310280334.4
• 申請(qǐng)日: 2013-07-04
• 公開（公告）號(hào): CN103343122A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)興洪;賈威;黃林彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種條斑紫菜耐高溫品系TM-18的分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

條斑紫菜是我國(guó)長(zhǎng)江以北紫菜的主要栽培品種，在經(jīng)濟(jì)海藻產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，行業(yè)總產(chǎn)值約30億元左右。

條斑紫菜是冷溫性海藻，處于育苗階段的紫菜絲狀體耐高溫，能自然度過夏秋高溫期，適宜的生長(zhǎng)溫度為20-25℃；絲狀體在秋初成熟，釋放出殼孢子，殼孢子萌發(fā)成長(zhǎng)為葉狀體，葉狀體在秋末、冬、春初的低溫下生長(zhǎng)，100個(gè)細(xì)胞以內(nèi)的幼藻體生長(zhǎng)適溫為18-20℃，并有一定的溫度耐受力，而大的藻體對(duì)溫度的耐受力差，溫度上升會(huì)導(dǎo)致提前衰老，且易發(fā)生病爛。近年來，殼孢子采苗期間及采苗后1個(gè)月左右的海水溫度回升現(xiàn)象連續(xù)多次發(fā)生，嚴(yán)重干擾了條斑紫菜的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致爛苗和掉苗，使紫菜產(chǎn)量大幅下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，條斑紫菜耐高溫品系的選育工作十分緊迫，已經(jīng)引起了研究者的廣泛重視。

近年來，條斑紫菜新品系的選育已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，并開始了小規(guī)模的生產(chǎn)性試驗(yàn)。王華芝等（王華芝,嚴(yán)興洪,李琳.條斑紫菜耐高溫品系的篩選及特性分析.海洋與湖沼,2012,43(2):363-369.）報(bào)道了條斑紫菜耐高溫品系TM-18的選育及生物學(xué)特性。

但受到海區(qū)環(huán)境等因素的影響，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以鑒別耐高溫品系與其他品系，限制了良種的推廣和應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)日趨成熟，可以從DNA分子水平檢測(cè)條斑紫菜品系間的變異，目前已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明目的在于提供一種用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的方法。

本發(fā)明還提供了用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的分子標(biāo)記、PCR擴(kuò)增特異性引物及其構(gòu)建方法，可以快速、準(zhǔn)確的對(duì)該條斑紫菜耐高溫品系進(jìn)行鑒別，為條斑紫菜選育、良種認(rèn)證提供依據(jù)。

本發(fā)明應(yīng)用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)條斑紫菜品系進(jìn)行分析，獲得條斑紫菜耐高溫品系TM-18的特異性條帶，經(jīng)過回收測(cè)序，得到了特異性條帶的序列信息，并根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，將特異性條帶轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。本發(fā)明的分子標(biāo)記可以用于快速準(zhǔn)確的鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18，可以作為良種認(rèn)證和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的分子標(biāo)記。

技術(shù)方案為，一種用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的分子標(biāo)記，含有如SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

一種用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的分子標(biāo)記的特異性擴(kuò)增引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.2和No.3所示：

正向引物：5’—TATCTTTGTATTGGGTTTGC—3’；

反向引物：5’—TTCCAGTAGGCGGTATCA—3’

上述特異性擴(kuò)增引物可應(yīng)用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18。

上述引物可用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18，方法包括以下步驟：

（1）總DNA的提取：收集新鮮的待鑒定條斑紫菜葉狀體，液氮研磨，提取總DNA；

（2）使用SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3的特異性擴(kuò)增引物，對(duì)步驟（1）中所獲得的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）取步驟（2）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)長(zhǎng)度為341bp的特異性片段，則所鑒定的條斑紫菜為條斑紫菜耐高溫品系TM-18；若沒有出現(xiàn)341bp的特異性片段，則所鑒定的條斑紫菜不是條斑紫菜耐高溫品系TM-18。

步驟（2）所述PCR擴(kuò)增的條件為：93～95℃預(yù)變性4.5～6min；93～94.5℃變性27～35s，51～52.5℃退火40～50s，71～73℃延伸40～50s，以上三個(gè)步驟重復(fù)32～40個(gè)循環(huán)；71～73℃延伸6～8min。

優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸45s，以上三個(gè)步驟重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

經(jīng)測(cè)序，條斑紫菜耐高溫品系TM-18中所獲得的長(zhǎng)度341bp的特異性片段，核苷酸序列為SEQ?ID?No.1中的第415至545的片段。

用于鑒定條斑紫菜耐高溫品系TM-18的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法包括以下步驟：

（1）總DNA的提取：收集各條斑紫菜選育品系的新鮮葉狀體，經(jīng)液氮研磨，使用DNA提取試劑盒，分別提取各品系的總DNA。