[發明專利]制備HBV持續感染動物模型的試劑和方法

有效

• 申請號: 201310280198.9
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN104278055B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 鄧強;藍柯;謝幼華;汪垣;齊治華;李改云
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/51;C12N15/10;A01K67/027
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種用于形成重組的乙型肝炎病毒共價、閉合、環狀DNA分子的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供一種構建物，所述構建物包括乙型肝炎病毒基因組序列SEQ ID NO:1，該乙型肝炎病毒基因組序列中插入一段外源的內含子序列，該內含子序列包括5’端拼接供體序列、3’端分枝點信號序列及拼接受體序列；并且，在5’端拼接供體序列與3’端分枝點信號序列及拼接受體之間，按照5’→3’依次包括質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列，所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列兩端設置位點特異性重組元件；所述的內含子序列插入于乙型肝炎病毒基因組nt202-203之間或nt2765-2766之間；

(2)將(1)的構建物轉染肝細胞，誘導所述的位點特異性重組元件以敲除所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列，從而在肝細胞內形成重組的乙型肝炎病毒共價、閉合、環狀DNA分子。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’端拼接供體序列包括：人β-globin基因第一內含子序列的5’端拼接供體序列，或人β2-microglobulin基因的第二內含子序列的5’端拼接供體序列。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3’端分枝點信號序列及拼接受體序列是免疫球蛋白重鏈基因內含子的3’端分枝點信號序列及拼接受體序列；或人β2-microglobulin基因的第二內含子序列的3’端分枝點信號序列及拼接受體序列。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的質粒復制序列是pUC Ori；和/或

所述的真核基因加尾信號是牛生長激素因子基因的polyA加尾信號序列。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的位點特異性重組元件包括：

LoxP，且應用Cre重組酶誘導LoxP以敲除所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列；或

FRT，且應用FLP重組酶誘導FRT以敲除所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的構建物是表達載體。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括：將(1)的構建物體外轉染肝細胞，誘導所述的位點特異性重組元件以敲除所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列，從而在肝細胞內形成重組的乙型肝炎病毒共價、閉合、環狀DNA分子。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，還包括共轉下調CD1d表達的抑制分子。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的下調CD1d表達的抑制分子是特異性干擾CD1d表達的shRNA。

10.一種用于形成乙型肝炎病毒共價、閉合、環狀DNA分子的構建物，其特征在于，所述構建物包括乙型肝炎病毒基因組序列SEQ ID NO:1，該乙型肝炎病毒基因組序列中插入一段外源的內含子序列，該內含子序列包括5’端拼接供體序列、3’端分枝點信號序列及拼接受體序列；并且，在5’端拼接供體序列與3’端分枝點信號序列及拼接受體序列之間，按照5’→3’依次包括質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列，所述的質粒復制序列、抗性篩選基因序列和真核基因加尾信號序列兩端設置位點特異性重組元件；所述的內含子序列插入于乙型肝炎病毒基因組nt202-203之間或nt2765-2766之間。