[發(fā)明專利]用改變tdcD酶調(diào)控元件的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310278997.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN103343148A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬吉銀;賈慧萍;孟剛;魏愛英;馬風(fēng)勇;李小剛;楊立鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/22
• 分類號(hào): C12P13/22;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法及其衍生的方法和應(yīng)用，和可以用在這些方法和應(yīng)用中的多核苷酸、載體和細(xì)菌。

背景技術(shù)

通過(guò)產(chǎn)l-色氨酸的細(xì)菌（如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細(xì)菌）發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)l-色氨酸已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。這些細(xì)菌，可以是從自然界分離的細(xì)菌，也可以是通過(guò)誘變或基因工程改造獲得的細(xì)菌，或者兩者兼而有之。當(dāng)前的文獻(xiàn)報(bào)道中，通過(guò)基因工程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因上（參見中國(guó)專利85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未見為了L-色氨酸生產(chǎn)而關(guān)注tdcD酶及其編碼基因，更未見對(duì)tdcD酶的調(diào)控元件加以改造，事實(shí)上國(guó)際專利WO2012135389公開了生產(chǎn)芳香氨基酸的氧化產(chǎn)物，其中甚至需要額外表達(dá)異源的tdc酶。

TdcD酶由tdcD基因編碼。在E.?coli?K12菌株及其衍生菌株（如，W3110菌株）等中，野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登錄號(hào)AP009048.1中第3263515-3262220位所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其上游具有調(diào)控（尤其是啟動(dòng)子）功能的序列（野生型的調(diào)控元件序列）如SEQ?ID?No：1所示，通過(guò)Genbank提供的同源性比較工具，也能夠找到其他野生型的tdcD基因的上游調(diào)控元件。

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究和實(shí)踐，尤其憑借了一些運(yùn)氣，偶然發(fā)現(xiàn)tdcD基因的上游調(diào)控元件的改造能夠有助于提高l-色氨酸的產(chǎn)量，而且本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，tdcD基因的調(diào)控元件不能簡(jiǎn)單地提高或敲除，尤其是敲除后將使得細(xì)菌生長(zhǎng)困難，難以實(shí)際應(yīng)用，因此開發(fā)了新的針對(duì)tdcD基因的調(diào)控元件的方法，以此來(lái)提高l-色氨酸的產(chǎn)量，而且更重要的是，該方法與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌的染色體改造位點(diǎn)沒(méi)有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實(shí)踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法及其相關(guān)的方法，包括相對(duì)于未改造細(xì)菌提高l-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的方法，改造的細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸中的應(yīng)用，改造的細(xì)菌在相對(duì)于未改造細(xì)菌提高l-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的應(yīng)用，和/或，改造細(xì)菌的方法等。另外，本發(fā)明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、載體和/或細(xì)菌等。

???????具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法，其包括：

（1）改造細(xì)菌染色體上tdcD基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的該調(diào)控元件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失；和，

（2）用步驟（1）改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸。

???????在本文中，術(shù)語(yǔ)“改造”指的是是相應(yīng)被改造的對(duì)象發(fā)生變化，從而達(dá)到一定的效果。改造位于染色體上的基因的手段包括但是不限于，誘變、定點(diǎn)突變、和/或同源重組，優(yōu)選是后兩者。這些技術(shù)手段廣泛記載于分子生物學(xué)和微生物學(xué)文獻(xiàn)中，有許多甚至已經(jīng)商品化了。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，根據(jù)同源重組的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV質(zhì)粒系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行改造，將未改造細(xì)菌染色體上tdcD基因的野生型的調(diào)控元件，改造成能夠使改造獲得的細(xì)菌的該調(diào)控元件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失的新的調(diào)控元件。因此，在本文文中，優(yōu)選改造是通過(guò)同源重組進(jìn)行的改造。

在本文中，術(shù)語(yǔ)“下游酶基因”指的是tdcD基因的野生型的調(diào)控元件所能調(diào)控的編碼酶的基因，而且該酶位于該調(diào)控元件的下游。所以，該調(diào)控原件一般是啟動(dòng)子。優(yōu)選在本文中，下游酶基因是tdcD基因。