[發(fā)明專利]一種快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物和方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310278876.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103320517A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 劉新富;劉濱;胡鵬;孟振;陳松林
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 王曉曉

1.一種快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物，其特征在于：所述引物包括擴增性別差異基因序列的上游引物F1、下游引物R1和含有針對單堿基突變位點的錯配堿基的下游引物Inner?R5，

所述上游引物F1：5’-TAGACACGATGCACACAAACCAC-3’；

所述下游引物R1：5’-?CGCAAAATGAGGCTCTCTATGGAG?-3’；

所述下游引物Inner?R5：5'-GCATCAGATTCCATCTGTTGTGAAGACC-3'。

2.根據(jù)權利要求1所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物，其特征在于：所述單堿基突變位點為G-C單核苷酸突變位點。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物，其特征在于：所述G-C單核苷酸突變位點位于紅鰭東方鲀Amhr2基因上的第9個外顯子上。

4.利用權利要求1所述引物快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于它包括以下步驟：采集待測紅鰭東方鲀幼魚樣品，提取紅鰭東方鲀幼魚的全基因組DNA；采用所述上游引物F1和下游引物R1進行第一輪PCR擴增，進行電泳檢測，呈現(xiàn)625bp條帶的為性別差異基因序列；將第一輪PCR產物稀釋后作為模板，采用所述上游引物F1和下游引物Inner?R5進行第二輪PCR擴增，進行電泳檢測，擴增出?334bp條帶的為紅鰭東方鲀雄性個體，該位置無擴增條帶的為紅鰭東方鲀雌性個體。

5.根據(jù)權利要求4所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于：第一輪PCR擴增體系為25μL反應體系，包括濃度10μM的引物F1和引物R1各為1μL，濃度2.5mM?的dNTP?1μL，濃度5U/μL?的Taq?DNA聚合酶0.5μL，10×Buffe?2.5μL，Mg^2+?15?μM，DNA模板1μL，去離子水?18μL。

6.根據(jù)權利要求5所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于：所述第一輪PCR反應條件為：預變性95℃5min，變性94℃60s，退火58℃45s，延伸72℃45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5?min。

7.根據(jù)權利要求4所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于：第二輪PCR擴增體系為25μL反應體系，包括濃度10μM的引物F1和引物R1各為1μL，濃度2.5mM?的dNTP?1μL，濃度5U/μL的Taq?DNA聚合酶0.5μL，10x?Buffe?2.5μL，Mg²⁺?15?μM，DNA模板1μL，去離子水?18μL。

8.根據(jù)權利要求7所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于：所述第二輪PCR反應條件為：預變性95℃1min，變性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5?min。

9.根據(jù)權利要求4所述的快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的方法，其特征在于：第一輪PCR產物稀釋50倍后作為第二輪PCR的模板。