[發明專利]有毒微囊藻菌株及其毒素純化方法

無效

• 申請號: 201310278386.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103484394A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 李效宇;周春娥;段紅英;劉洋;張榜軍;馬軍國;方倩
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/04;C07K7/56;C07K1/14;C12R1/01
• 代理公司: 中國商標專利事務所有限公司 11234
• 代理人: 毋軍

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技術領域????

本發明涉及一種高產毒微囊藻菌株的分離培養及其毒素純化方法，微生物技術領域。

背景技術

近年來由于水體富營養化而導致藍藻水華?(cyanobacterial?bloom)?的頻繁發生已成為國內外普遍關注的水環境污染問題。我國目前66%以上的湖泊、水庫處于富營養化狀態，其中重富營養和超富營養的占22?%;?70?%以上河流受到程度不同的污染,?富營養化和藍藻水華是我國當今最大的水環境問題。我國大型湖泊藍藻水華頻繁發生，尤其是滇池、太湖、巢湖等，如2007年太湖藍藻水華曾導致無錫市居民飲用水危機，引起新聞媒體和政府的高度關注。藍藻水華不僅污染水體、破壞飲用水源、造成漁業損失,?而且多數藍藻水華由于產生藍藻毒素?(cyanotoxin)?還影響和危害水生動物甚至人的健康。藍藻水華最常見的藍藻是銅綠微囊藻（Microcystis?aeruginosa），而且大多產生藍藻毒素?(cyanotoxin)?從而影響和危害水生動物甚至人的健康。微囊藻毒素?(microcystins，MCs)?是藍藻毒素中最常見的一類肝毒素，具廣譜生物毒性，長期慢性低劑量暴露?(如通過飲用水途徑)，MC可引起易感人群患肝炎并促發肝癌。?

MC一般由7個被修飾過的氨基酸構成的環狀小肽，常見有MC-LR、MC-RR和MC-YR?3種，其中MC-LR的毒性最高（一般是MC-RR的10倍），而且是世界衛生組織?(WHO)?制定飲用水標準的種類。MC化學結構穩定不易降解，抗pH和高溫，加熱煮沸只能小部分降解（不大于20?%）。常規自來水處理工藝，如加氯、過濾等都不能徹底消除水中MC。因此，在發生微囊藻水華的河流、湖泊、水庫甚至居民自來水中，都可能存在MC。WHO?1998年已經推薦了飲用水微囊藻毒素（MC-LR）限量標準為1mg/L，我國衛生部2002年采用了該標準。?

MC主要用于毒理學、生物學和肝病相關實驗研究，目前國內只有1-2家公司出售。分離、純化有毒微囊藻菌株，使其達到高產此類菌株；同時，優化分離和純化毒素的方法技術，降低成本并減少環境污染，對于微囊藻毒素的研究具有重要意義。?

發明內容

本發明目的在于提供一株能高產微囊藻毒素的有毒微囊藻菌株；另一目的在于提供其純化方法，降低成本并減少環境污染。?

為實現本發明目的，在河南省某水庫通過采集水樣，進行分離培養并獲得單種培養物，經鑒定為銅綠微囊藻（Microcystis?aeruginosa?MN001）;?于2013?-?4?-?15送中國典型培養物保藏中心（CCTCC）保藏（地址武漢市武昌路珞珈山，武漢大學），保藏號CCTCC?M?2013146。?

該藻株具有以下生物學特征：?

1.??生長速度較快，容易繼代和大量培養；

2.??批量培養后進行毒性鑒定，發現為有毒微囊藻，產生的主要毒素為MC-LR；

3.??所產毒素含量高（HPLC檢測結果）；毒性強（所產MC為MC-LR）；能長期大量培養且形態和遺傳性狀不易改變；長期培養毒性不減弱或喪失（急性毒性實驗結果）；可以用廉價培養基，如BG-11替代MA培養基而毒性不變化。

4.??目前國內微囊藻株產生的毒素多為MC-RR，MC-RR毒性低、價格也低；優勢是該藻株產生毒素為MC-LR并具有一些較突出的特點和優勢。?

有毒微囊藻株的分離培養及其毒素制備和初步純化的方法如下：?1）首先在河南省某水庫采集水樣，顯微鏡鑒定種類；?

2）采用微吸管法在顯微鏡下進行目的微囊藻的分離；

3）將分離的單個群體微囊藻轉入培養瓶內在光照培養箱內進行光照培養，培養條件和參數：培養基為MA培養基、溫度25℃、光照強度2?000?lux、培養液pH?8.6；靜置培養、不通氣。

4）培養1個月后，待單種微囊藻培養物生長良好后（培養瓶呈現較濃的藍綠色），將單種微囊藻培養物進行擴大培養，即用該單種微囊藻培養物作為藻種，用1?L?培養瓶進行通氣培養，培養條件和參數同上。?

5）擴大培養后進行批量/大量培養，即用該單種微囊藻培養物作為藻種，用10?L?培養瓶進行通氣培養，培養條件和參數同上。?

6）獲得大量培養物后，用小白鼠進行急性毒性試驗，檢測該藻株的毒性；?

7）實驗室保存該單種微囊藻培養物并送中國典型培養物保藏中心（CCTCC）保藏。

8）大量培養該單種微囊藻培養物，收集培養物離心后獲得藻漿；?