[發明專利]磺胺二甲嘧啶化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310277742.4
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103344758A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 吳健敏;馬玲;韋建興;白安斌;覃紹敏;陳鳳蓮;林俊;劉金鳳
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N21/76;C07K16/44
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于化學發光酶免疫分析技術領域，尤其涉及一種磺胺二甲嘧啶化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒。

背景技術

磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM₂）又稱磺胺二甲基嘧啶、磺胺間二甲嘧啶，是畜牧養殖業中應用最廣的磺胺類藥物之一，常用做飼料添加劑和細菌性疾病的治療藥物，長期添加或濫用可導致動物性食品中的藥物殘留，對人類健康造成威脅。研究發現，人體通過任何途徑攝入都可以在體內蓄積，影響機體的免疫系統，破壞肌肉、腎臟、甲狀腺等組織，同時可誘發甲狀腺癌；而且，該藥也可以通過胎盤和乳汁從母體向胎兒或新生兒轉移，使其血漿和腦組織中的甲狀腺素水平降低，這對人類和動物的腦發育有深遠影響。另一方面，磺胺二甲嘧啶的殘留容易誘導細菌的耐藥性，使藥物失去治療疾病的價值。因此，聯合國食品法典委員會和歐盟等規定，食品和飼料中磺胺類藥物單個均不得超過100μg/kg；日本規定的最高殘留限量為10μg/kg；2002年12月我國農業部公告第235號文件規定，在所有食品動物的肌肉、脂肪、肝和腎中，磺胺類最高殘留限量為100μg/kg，并將其列為獸藥殘留監控重點。

目前，檢測磺胺二甲嘧啶的方法有微生物法、理化方法（如高效液相色譜法、薄層層析等）和免疫分析法（放射免疫分析法、酶聯免疫吸附法、化學發光免疫分析法等）。其中，微生物法簡便、快速、廉價，適合基層現場篩查，但易受其它生物影響，靈敏度低、漏檢率高；理化方法精密度高、準確度高，但是儀器昂貴、專業性強、檢測時間長，可用于疑似樣品的確證；免疫分析法操作簡便、快速、特異、靈敏度高，近年來已被應用于多種藥物殘留的檢測，但有關檢測磺胺二甲嘧啶殘留的化學發光酶免疫分析法尚未見報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種經濟、簡便、快速、特異、靈敏、準確的磺胺二甲嘧啶化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒和該試劑盒在動物源性食品中磺胺二甲嘧啶殘留檢測中的應用。

本發明要解決的另一技術問題是提供一種特異性強的磺胺二甲嘧啶單克隆抗體。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：磺胺二甲嘧啶化學發光酶免疫分析檢測法，包括以下步驟：

<1>處理待測樣品；

<2>將半抗原磺胺二甲嘧啶與載體蛋白卵清蛋白的偶聯物（SM₂-OVA）作為抗原包被于發光固相載體，封閉后，分別加入系列標準樣品或經前處理的待測樣品，再加入磺胺二甲嘧啶單克隆抗體進行反應；

<3>經步驟<1>后，加入酶標二抗進行反應，然后再加入化學發光液，測定系列標準樣品和待測樣品的發光值；

<4>以步驟<3>測得的發光值計算抑制率，繪制標準曲線，并根據標準曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中磺胺二甲嘧啶的含量。

步驟<1>參照農業部1025號公告－24-2008標準進行；步驟<2>按以下操作進行：用包被液按1:100000稀釋包被抗原，每孔加入100μL，4℃孵育10h后，傾去包被液，用洗板機洗滌化學發光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封閉液，37℃孵育1h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37℃烘干后，用錫箔紙真空密封，4℃保存；將化學發光板從4℃中取出，平衡至室溫，按照每孔50μL將系列標準樣品溶液和待測樣品加入化學發光板，各設3孔重復，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶單克隆抗體，混勻，37℃孵育30min；傾去液體，用洗板機洗滌3次，拍干；步驟<3>按以下操作進行：每孔加入50μL1:2500稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入100μL化學發光液，混勻，盡快測定各孔發光值。

封閉液是5%的脫脂奶粉；磺胺二甲嘧啶單克隆抗體的稀釋倍數為1:1500；系列標準樣品溶液的濃度為0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；包被液是pH9.6的碳酸鹽緩沖液。