[發明專利]一種用于畢赤酵母表達重組人血清白蛋白的基因序列有效

申請號：	201310277310.3	申請日：	2013-07-03
公開（公告）號：	CN103397036A	公開（公告）日：	2013-11-20
發明（設計）人：	倪世明;符美娟;丘力功;黃明;韋劍;王燦頂;蔡小杰	申請（專利權）人：	廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司
主分類號：	C12N15/14	分類號：	C12N15/14;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
代理公司：	廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205	代理人：	譚英強
地址：	511495 廣***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種用于酵母表達重組血清白蛋白基因序列
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說涉及一種優化的用于畢赤酵母重組表達人血清白蛋白的基因序列和表達該基因的甲醇畢氏酵母工程菌。

背景技術

人血清白蛋白（HSA）在人體內重要的生理功能，?主要用于臨床糾正因大手術、創傷、器官移植等引起的急性血容量減少；處理大面積燒傷、呼吸窘迫等引起的水、電解質和肢體平衡失調，以防止和控制休克；還用于急胃腸出血、腎透析以及嚴重的慢性疾患，如消化道吸收不良、肝硬變、腎病綜合癥、腦血管意外或腦局部缺血等內科疾病，特別是合并水腫的病例。人血白蛋白（HSA）還是生物制藥必不可少的保護劑和賦形劑。

天然的HSA是由人類血漿提取的一類血液制劑藥品，是現代醫學用于預防和治療不可缺少的藥品，它是一類特殊的藥品，其唯一原料是人血，一方面受社會、經濟和政治因素的制約，不能隨意開發，一方面是維系生命的重要物質，受原料短缺制約，臨床應用受限，屬于緊缺藥品，另一方面由于血液難免被各種病原體感染，如：愛滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等，血液制品的用藥安全成為國際社會關注的突出問題。

基于以上來源和安全性的原因，利用基因重組技術大規模生產重組人血清白蛋白成為必然的選擇。

由于HSA含有多個二硫鍵，采用原核系統很難得到正確折疊的表達產物；而使用哺乳細胞或昆蟲細胞則在表達量和成本方面存在突出的問題，通常重組HSA的表達是采用較為低等的真核表達系統特別是用酵母的方式進行。如將在AOX1啟動子控制下的HSA基因導入巴斯德畢赤酵母以得到轉化細胞，得到可通過甲醇誘導的HSA表達工程株。有學者對畢赤酵母重組表達的HSA進行了比較實驗，結果表明兩者幾乎完全相同。為了進一步提高HSA在酵母中的表達產率，有通過HSA編碼序列進行修飾，通過改變基因結構以改進目標基因表達效率和水平的方法報道。如在98102506.4的中國發明專利提供的技術方案為：去除編碼序列的內含子的剪接位點、非轉錄終止區的轉錄終止序列、長的重復序列、內部啟動子序列及核糖體位點的修飾的基礎上改造HSA基因密碼子，使表達HSA的基因基本由酵母偏性密碼子組成。

我們在HSA基因序列優化改改造研究中，綜合考慮密碼子的宿主偏性、基因GC含量、CpG含量、mRNA二級結構、序列的內含子的剪接位點、RNA結構不穩定序列、非轉錄終止區的轉錄終止序列、長的重復序列、等與基因表達效率相關的因素，設計了包括中國發明專利98102506.4中公開的基因序列在內的幾個HSA序列優化方案。研究結果表明，將優化方案中的基因整合進腺苷合成缺陷型的PichiaPink畢赤酵母后都能表達HSA，但其中一個優化方案的序列對應的表達量不僅高于天然基因的表達量，也顯著高于包括中國專利98102506.4中的公布序列在內的其他的優化方案的序列的表達量。此最佳方案的優化的基因序列與中國發明專利98102506.4的表達HSA的序列之間除了信號肽區不同外（前者為HSA信號肽，后者為α因子前原序列），在其他編碼序列亦存在顯著的區別。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能在腺苷合成缺陷型的PichiaPink畢赤酵母高效表達的人血清白蛋白（HSA）的基因序列。

本發明的另一個目的在于提供一種攜帶上述基因的PichiaPink工程重組菌株。

本發明的另一個目的在于利用上述PichiaPink工程重組菌株生產重組人血清白蛋白。

本發明所采取的技術方案是：

一種經優化的表達人血清白蛋白的基因，其具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

一種甲醇營養型的巴斯德畢赤酵母基因工程重組菌，其含有上述經優化的表達人血清白蛋白的基因。

所述的基因工程重組菌，其為Mut+表型的PichiaPink??工程重組菌。

上述工程重組菌在生產重組人血清白蛋白中的應用。

一種克隆載體，其含有上述經優化的表達人血清白蛋白的基因。

一種表達載體，其含有上述經優化的表達人血清白蛋白的基因。起始載體可為pPink-LC載體、p-PINK-HC載體或其它可選用的高拷貝篩選用質粒。

一種甲醇營養型的巴斯德畢赤酵母基因工程重組菌，其含有上述的表達載體。