[發明專利]抗泥鰍病原霍亂弧菌的卵黃抗體滅活疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201310276567.7
• 申請日: 2013-07-03
• 公開（公告）號: CN103301457A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 張曉君;陳麗;畢可然;秦國民
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K39/106;A61K9/107;A61P31/04;A61K39/40
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 畢東峰

技術領域

本發明涉及一種滅活疫苗的制備方法，特別涉及一種抗泥鰍病原霍亂弧菌的卵黃抗體滅活疫苗的制備方法。?

背景技術

泥鰍（Misgurnus?anguillicaudatus?L）是我國主要淡水經濟魚類之一，其肉質鮮嫩，營養豐富，具有食用、藥用雙重價值，深受消費者的青睞。近年來，由于韓國、日本等周邊市場對我國泥鰍的大量需求，泥鰍人工集約化養殖迅速發展，尤其是在蘇北地區已形成了大規模養殖，但隨之而來的病害問題已嚴重制約了泥鰍養殖業的發展。近年來我們在對泥鰍細菌性疾病調研中，發現霍亂弧菌為泥鰍細菌性疾病的主要流行病原菌之一，嚴重危害泥鰍養殖生產。該菌廣泛分布于水環境，已知有不少血清型株能引起水產動物感染發病，該菌還可引起人散發胃腸炎，在特殊條件下也可引起敗血癥、腦膜炎、傷口感染等腸道外感染，是人和水產養殖動物共染的病原菌。因此，對泥鰍病原霍亂弧菌的高效預防，以最大限度地降低其危害程度，將能顯著地提高泥鰍養殖生產的經濟效益。?

在泥鰍細菌性疾病防控方面，常使用化學合成藥物或抗生素類藥物控制疾病的發生與流行，但在長期的藥物使用中，藥物在動物體中殘留，危害到人類的健康，且長期用藥帶來環境污染，并導致耐藥性微生物大量出現，同時已成為出口創匯的壁壘，嚴重影響了泥鰍養殖業的發展。目前泥鰍養殖生產中很難控制霍亂弧菌引起的疾病的發生與流行，市場上缺乏一種使用方便的抗泥鰍病原霍亂弧菌的免疫制劑。因此，應用免疫學技術預防泥鰍細菌性疾病的發生已成為泥鰍養殖產業持續、健康、穩定發展的重要內容，對于有效控制泥鰍病原霍亂弧菌病的發生與流行具有重要的應用前景。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種提高泥鰍針對病原霍亂弧菌的免疫力、降低泥鰍養殖生產中由病原霍亂弧菌所造成的危害、以滿足泥鰍養殖生產上的抗病需求的抗泥鰍病原霍亂弧菌的卵黃抗體滅活疫苗的制備方法。?

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種抗泥鰍病原霍亂弧菌的卵黃抗體滅活疫苗的制備方法，其特點是：它以經甲醛溶液滅活后的泥鰍病原霍亂弧菌（Vibrio?cholerae)?NQ1作為免疫原，以白油、司班80、硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下：?

（1）將泥鰍病原霍亂弧菌NQ1菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，28-30℃搖床培養24h，加入體積終濃度0.3%的甲醛28℃滅活48h，離心得滅活菌體；

（2）取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥1g/mL，得黃芪浸出液；

（3）將白油加熱至50-55℃，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3：100?g?/?ml，繼續加熱至65-70℃，加入司班80，司班80與白油的體積比為5-7：100，直至終溫度115-120℃，維持15-20?min，制得油相，冷卻備用；

（4）將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中泥鰍病原霍亂弧菌NQ1免疫原為10¹²cells/mL，黃芪浸出液為1g/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80；

（5）將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的泥鰍病原霍亂弧菌油乳劑滅活疫苗。

本發明所述的泥鰍病原霍亂弧菌NQ1已經在公開文獻《Identification?of?Vibrio?cholerae?as?a?causative?bacterium?for?an?ulcer?disease?of?cultured?loach?Misgurnus?anguillicaudatus?in?China》中所公開（菌株NQ1），上述公開文獻發表于《African?Journal?of?Microbiology?Research》，2012，6（9）：2060-2070。菌株NQ1的DNA序列長度及Genebank登錄號見下表：?

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該菌株NQ1為公知公用材料，現保存在淮海工學院海洋學院實驗室，在本專利申請日起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外發放。