[發(fā)明專利]豬IFNɑ1-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達(dá)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310274978.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103319608A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬永;錢林;徐春林;陳晨;王耀方
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司;常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N7/01;C12N15/866;A61K38/21;A23K1/16
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和生物工程技術(shù)，尤其是涉及一種豬IFNɑ1-Fc融合蛋白及其編碼基因和利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)豬IFNɑ1-Fc融合蛋白的方法。

背景技術(shù)

干擾素(Interferon，IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。根據(jù)IFN的來(lái)源即動(dòng)物種類、細(xì)胞類型、誘生劑的性質(zhì)和誘生條件不同，可分為α、β、γ三種。其中的IFN-α抗病毒活性最強(qiáng)，并同時(shí)具有抗腫瘤、抗菌、抗原蟲(chóng)、治療自身免疫性疾病等效應(yīng)，因此被廣泛的用于病毒性肝炎、癌癥及多發(fā)性硬化癥等多種疾病的臨床治療。但由于干擾素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特點(diǎn)，在臨床中需要頻繁注射給藥才能達(dá)到治療的效果。

目前豬干擾素的批量生產(chǎn)主要有誘導(dǎo)血液淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN法和大腸桿菌異源表達(dá)法。前一種方法以動(dòng)物細(xì)胞為原料，生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品有攜帶外源病毒和其他病原微生物的危險(xiǎn)。相比之下，大腸桿菌異源表達(dá)法具有產(chǎn)量大、純度高、適合規(guī)?；a(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量容易控制等優(yōu)點(diǎn)，但是其生產(chǎn)工藝相對(duì)較繁瑣。并且，由于大腸桿菌體系內(nèi)缺乏蛋白翻譯后加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物多以無(wú)活性的包涵體形式產(chǎn)生。而包涵體的復(fù)性過(guò)程復(fù)雜、復(fù)性率低，從而導(dǎo)致蛋白比活性也較低。另外，大腸桿菌表達(dá)體系的產(chǎn)品純度不高，含有其他雜蛋白，分離純化較困難。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)IFNɑ1半衰期段及缺乏適宜的異源表達(dá)體系的問(wèn)題，首先，發(fā)明人將IgG的Fc片段與IFNɑ1連接構(gòu)成融合蛋白，利用IgG的Fc片段可以和新生的Fc受體(FcRn)結(jié)合而避免被溶酶體降解的性質(zhì)，使IFNɑ1-Fc融合蛋白達(dá)到長(zhǎng)效作用的目的；其次，發(fā)明人采用了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IFNɑ1-Fc融合蛋白，經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，使目的蛋白的生化性質(zhì)及生理活性方面與天然蛋白基本相似且表達(dá)效率明顯增高。

本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種豬IFNɑ1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有豬ɑ1干擾素蛋白序列的成熟肽部分，同時(shí)，在豬ɑ1干擾素蛋白序列C端的終止密碼子之前添加有Fc標(biāo)簽蛋白序列。

本發(fā)明的上述所述豬IFNɑ1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

本發(fā)明還提供了一種豬IFNɑ1-Fc第一優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明還提供了一種豬IFNɑ1-Fc第二優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發(fā)明還提供了一種豬IFNɑ1-Fc第三優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示。

本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有上述所述的豬IFNɑ1-Fc第一、第二或第三優(yōu)化基因，所述質(zhì)粒優(yōu)選為Bacmid。

本發(fā)明還提供了一種病毒，所述病毒具有上述所述的質(zhì)粒，所述病毒優(yōu)選為桿狀病毒，最優(yōu)選為BmNPV。

本發(fā)明還提供了一種豬IFNɑ1-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，包含如下步驟：

(1)在合適的條件下將上述所述的病毒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞或穿刺接種家蠶幼蟲(chóng)；

(2)家蠶BmN細(xì)胞或家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)豬IFNɑ1-Fc融合蛋白。

優(yōu)選的，所述表達(dá)方法步驟如下：

(1)將豬IFNɑ1-Fc第二優(yōu)化基因或第三優(yōu)化基因克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移表達(dá)載體pFastBac?Dual中；

(2)通過(guò)位點(diǎn)的特異性轉(zhuǎn)座，將轉(zhuǎn)移表達(dá)載體上的所述豬IFNɑ1-Fc第二基因或者第三基因整合入Bacmid桿狀病毒質(zhì)粒完成病毒基因組的重組；

(3)將步驟(2)中整合了豬IFNɑ1-Fc第二優(yōu)化基因或第三優(yōu)化基因的桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒并完成重組桿狀病毒的擴(kuò)增，并用桿狀病毒穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲(chóng)；所述家蠶幼蟲(chóng)優(yōu)選為4或5齡的家蠶幼蟲(chóng)；

(4)經(jīng)重組病毒感染的家蠶BmN細(xì)胞和經(jīng)接種的家蠶幼蟲(chóng)可表達(dá)豬IFNɑ1-Fc融合蛋白。