[發(fā)明專利]豬鏈球菌2型htpsA基因敲除突變株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310274301.9
• 申請(qǐng)日: 2013-07-02
• 公開（公告）號(hào): CN103352015A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘秀珍;李敏;王晶;王長(zhǎng)軍;邵珠卿;李先富;高基民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N15/09;C12N15/63;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 夏平;傅婷婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及豬鏈球菌2型htpsA基因敲除突變株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬鏈球菌2型（S.suis2）是一種危害全球的人畜共患病病原菌。該病原菌不僅可致豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎及心內(nèi)膜炎等，而且還可感染人,給相關(guān)從業(yè)者和廣大群眾的生命安全造成嚴(yán)重威脅。根據(jù)其莢膜多糖的抗原性，可分為35個(gè)血清型，其中2型（SS2)毒力最強(qiáng)，臨床檢出率最高。近年我國南方省份的豬群中S.suis2流行日趨嚴(yán)重，時(shí)有較大規(guī)模暴發(fā)，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。1998和2005年分別在我國江蘇和四川資陽暴發(fā)大規(guī)模SS2感染人事件，造成了重大生命財(cái)產(chǎn)損失，并且病人中出現(xiàn)了高比例的、國內(nèi)外罕見的中毒性休克綜合征，病情兇險(xiǎn)，病死率高（60%～80%），引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。上述情況強(qiáng)烈提示引發(fā)這兩次流行的SS2毒力極強(qiáng)，很可能發(fā)生了毒力變異或獲得了毒力相關(guān)的遺傳物質(zhì)。近年來國際上關(guān)于S.suis感染和致病的報(bào)道顯著增多，并有報(bào)道顯示在我國香港已經(jīng)檢測(cè)出該菌多重耐藥菌株的存在，給S.suis2的預(yù)防和控制帶來了新的挑戰(zhàn)。因此，開展S.suis2致病機(jī)制的相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，對(duì)于防控S.suis2感染在人畜中的流行具有重要意義。但是，目前關(guān)于S.suis感染宿主并致病的分子機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)一步探索研究新的致病相關(guān)基因的功能及其在S.suis與宿主相互作用中發(fā)揮的作用，對(duì)篩選潛在的疫苗候選分子、揭示其發(fā)生發(fā)展的精確分子機(jī)制，進(jìn)一步提高我國S.suis預(yù)防和治療水平具有重要意義。

對(duì)于豬鏈球菌毒力因子的研究一直是一個(gè)熱點(diǎn)，目前已被確切證實(shí)的毒力因子只有莢膜多糖(CPS)一個(gè)。其它已知的與S．suis致病性相關(guān)的毒力因子包括溶菌酶釋放蛋白(muraminidase?released?protein，MRP)、胞外因子(extracellular?factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)、谷氨酸脫氫酶（glutamate?dehydrogenase,GDH）、分選酶A(sortase?A)、二肽酶Ⅳ（Dipeptidyl?Peptidase?IV）、烯醇化酶（Enolase）以及豬鏈球菌組氨酸三聚體蛋白（Histidine?triad?protein?of?S.suis，Htps）等。這些毒力因子的發(fā)現(xiàn)對(duì)理解S.suis的致病過程有一定的幫助。但是眾所周知，細(xì)菌的致病過程是其與宿主細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程。細(xì)菌接觸宿主之后，必須克服宿主機(jī)體的防御機(jī)制，特別是要干擾或逃避局部的吞噬作用及體液免疫介導(dǎo)的免疫作用，才能建立感染。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，細(xì)菌形成了多種免疫逃避機(jī)制，依靠調(diào)控自身表達(dá)多種成分通過不同的機(jī)制來逃避宿主的免疫系統(tǒng)。

Htp家族蛋白是在鏈球菌中新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白家族。近年的報(bào)道顯示A、B、C、G群鏈球菌中都發(fā)現(xiàn)了Htp家族蛋白成員，并且對(duì)化膿鏈球菌和無乳鏈球菌中該家族成員功能的相關(guān)研究也已見諸報(bào)道，但尚無人對(duì)S.suis中該基因功能及其參與細(xì)菌致病的分子機(jī)制進(jìn)行研究。本課題組通過對(duì)S.suis2人源分離的強(qiáng)毒株05ZYH33的基因組分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)組氨酸三聚體蛋白（histidine?triad?protein，Htp）編碼基因，其開放閱讀框分別為05SSU0332、05SSU1267、05SSU1577（分別命名為HtpsA、HtpsB、HtpsC），證實(shí)了S.suis205ZYH33中Htp家族蛋白的存在，并在國內(nèi)外率先開展了對(duì)S.suis2中該家族蛋白的相關(guān)功能研究。據(jù)報(bào)道在肺炎鏈球菌中，該Htp家族由四個(gè)序列高度相似的成員組成，該菌中編碼Pht蛋白的任何一個(gè)單基因缺失突變株或者雙基因缺失突變株均不能引起菌株毒力明顯的改變，只有當(dāng)編碼該蛋白的四個(gè)成員的基因全部敲除，菌株毒力才會(huì)有明顯下降。有文獻(xiàn)報(bào)道在2型豬鏈球菌P1/7中，HtpsA的同源物基因的缺失并未對(duì)親本的毒力產(chǎn)生任何影響。