[發明專利]一種同步檢測5種植物病毒的方法

有效

• 申請號: 201310274031.1
• 申請日: 2013-07-02
• 公開（公告）號: CN103540681A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 楊會房;青玲;王春艷;劉陳晨;孫現超
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種同步檢測5種植物病毒的方法，其特征在于通過以下步驟實現：

（1）取待測植物葉片，提取總RNA?，以提取的總RNA為模板，反轉錄為cDNA；

（2）以cDNA為模板，采用下列5對引物進行多重PCR擴增，得到擴增產物；

第1對引物：

CMV-F：5'-GATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3'

CMV-R：5'-GCTCGATGTCGACATGAAGT-3'

第2對引物：

TuMV-F：5'-GTGCATTGAGAACGGAACCTC-3'

TuMV-R：5'-GATTAACGTCCTCGGTCGTATG-3'

第3對引物：

PVX-F：5'-GGATCCATGACTGCACCAGCTAGC-3'

PVX-R：5'-GAATTCTGGTGGTGGTAGAGTGAC-3'

第4對引物：

PVY-F：5'-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3'?

PVY-R：5'-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3'

第5對引物：

TMV-F：5'-CAGCTGCTATTGACCTTGAAAC-3'

TMV-R：5'-CAATATCAATGATGCCAGAC-3'

（3）用TAE電泳緩沖液配制1％瓊脂糖凝膠，取8μL?PCR產物在水平電泳槽中進行電泳，120V/100mA電泳35分鐘，根據條帶圖判定病毒種類；

5種植物病毒為：煙草花葉病毒（Tobacco?mosaic?virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber?mosaic?virus，CMV）、蕪菁花葉病毒（Turnip?mosaic?virus，TuMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato?virus?Y，PVY）和馬鈴薯X病毒（Potato?virus?X，PVX）。

2.根據權利要求1所述的一種同步檢測5種植物病毒的方法，其特征在于步驟（2）多重PCR擴增反應體系為：2.5μL?10×PCR?buffer(Mg^2+?free)，0.6μL?rTaqDNA酶(5U/μL)，3μL?dNTP?Mixture(2.5mmol/L)，2μL?MgCl₂(25mmol/L)，0.5μL?TMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL?TMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL?CMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL?CMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL?TuMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL?TuMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL?PVX-F引物(20μmol/L)，0.5μL?PVX-R引物(20μmol/L)，0.5μL?PVY-F引物(20μmol/L)，0.5μL?PVY-R引物(20μmol/L)，5μL反轉錄產物作為cDNA模板，其余用ddH₂O補充至25μL；反應程序為：94℃預變性3min后開始以下循環反應：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸100s，35個循環結束后，72℃延伸10min。