[發明專利]一種提取棉花干種子基因組DNA的方法

無效

• 申請號: 201310272540.0
• 申請日: 2013-07-01
• 公開（公告）號: CN103382470A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 郎需勇;游艾青;別傳述;劉立清;劉定富;劉偉霞;楊亮
• 申請（專利權）人: 湖北惠民農業科技有限公司;湖北省農業科學院糧食作物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司 42215
• 代理人: 王健

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種適用于棉花干種子基因組DNA的快速提取方法。

背景技術

棉花種子純度的鑒定方法有棉花種子鑒定法（種子形態特征鑒定法、纖維平均長度鑒定法、纖維整齊度鑒定法、纖維長度變異系數鑒定法）、棉花幼苗形態特征鑒定法、棉花水溶性蛋白電泳鑒定法、田間小區種植鑒定法、田間檢驗及DNA分子標記鑒定法。傳統的純度鑒定是通過海南田間小區反季節種植鑒定和本地田間小區正季種植鑒定，前者可在農戶播種之前知道種子純度，雖然可以避免因種子不純給農戶造成的損失，但公司的損失已無可挽回（種子款已付給制種農戶），而且海南鑒定結果準確性差，時間也偏晚，結果出來時，部分種子已賣到農戶手中，難以收回。后者雖然結果準確，但時間晚，公司和購種農戶的損失都已發生，不可避免，只能作為種子的后控措施。SSR分子檢測技術可以在短時間內檢測出轉基因雜交棉種子純度，速度快，準確性高，可有效防止制種農戶摻雜使假。

應用SSR分子檢測過程中，對基因組DNA高效、快速提取是基本環節。目前已有多種DNA提取方法，如SDS、CTAB等方法可提取高質量、高產量DNA。這些方法應用于SSR作物輔助育種或者雜交種純度鑒定對大量樣本進行分析時，要求基因組DNA提取人員操作熟練，整個過程步驟繁瑣、耗時較長、試劑繁多且成本較高，另外對儀器設備有特殊要求等，這些缺點限制了其應用。

因此，為了及時準確地完成對大批量樣本的SSR分子標記鑒定工作，必需建立簡單、高效、穩定的DNA快速提取方法。

發明內容

本發明的目的是建立簡單、高效、穩定的一種提取棉花干種子基因組DNA的方法。

本發明的一種提取棉花干種子基因組DNA的方法，包括以下步驟：

1)取棉花干種子胚于200μL96孔PCR板中；

2)向裝有棉花干種子胚的PCR板的每個孔中加入50μL?DNA提取緩沖液，然后于94℃保持15～20min；

3)棄上清，重復步驟2）一遍得到棉花干種子基因組DNA原液；

4)向裝有棉花干種子胚和提取緩沖液的PCR板的每個孔中加入150μL?ddH₂O稀釋得到棉花干種子基因組DNA工作液；

前述的DNA提取方法，步驟1）所取棉花干種子胚可以為半胚或整胚，但是不能粘有胚以外的任何其他物質；

步驟2）中的提取緩沖液為100mmol/L?Tris，pH值8.0；10mmol/L?EDTA，pH值8.0；1mol/L?KCl。

優選的，步驟2）中的提取緩沖液成分中100mmol/L?Tris為100mmol/L?Tris-Base，pH值8.0。

優選的，步驟2）中混合體系置于PCR擴增儀中進行反應。

優選的，步驟3）中去上清是指將96孔PCR板置于臺式離心機3000rpm2min，待棉花干種子胚沉于PCR板底部，直接倒掉上清液。

優選的，步驟4）中向棉花干種子胚中加入150μLddH₂O稀釋，便于后續的PCR產物擴增。

本發明至少具有以下優點：

（一）本發明所述的DNA提取方法不需要對樣品進行研磨，同時省去了氯仿抽提蛋白質、異丙醇沉淀DNA、無水乙醇和75%乙醇洗滌DNA以及DNA的風干和溶解等步驟，省時、省力、省試劑且安全、無毒、無污染，是一種環境友好型的DNA提取方法。

（二）本發明所述的DNA提取方法采用96孔板裝載反應物，提取過程僅需3步，試劑單一、操作簡單，所有操作都在一塊96孔PCR板中進行，具有高通量性，適用于大批量DNA提取的需要。

（三）本發明所述的DNA提取方法始終在一塊PCR板中進行，提取過程中無需轉換基因組DNA提取的器皿，避免了DNA提取過程中的交叉污染。

（四）本發明所述的DNA提取方法省去了常規方法提取中蛋白質抽提、DNA沉淀、洗滌、風干和溶解等步驟，同時也省去了多次上清液抽取和轉移等步驟，避免了常規方法中因步驟繁瑣而可能造成的DNA提取失敗。

（五）本發明所述的DNA提取方法整個提取過程為高溫、高鹽環境，無RNA等雜質的污染，提取的基因組DNA質量較好，完全可以滿足SSR-PCR分子標記分析的需要。

附圖說明